In het stuk ‘Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)’ hadden we het al over een studie waar dezelfde onderzoeksgroep geen verschillen (t.o.v. controles) vond aangaande herpesvirus-serologie (aanwezigheid van antilichamen; o.a. tegen het Epstein-Barr virus). Men analyseerde nu dezelfde gegevens (verkregen via de UKMEB biobank) opnieuw na opdeling van de M.E.(cvs)-patiënten in subgroepen en vond dat bepaalde verschillen nu wel statistisch significant waren…

Er wordt dikwijls beschouwd dat M.E.(cvs) wordt getriggerd een acute virale infektie (verscheidene herpesvirussen). Ook deze studie waar men 4 subgroepen (op basis van infektie-trigger) onderzocht, levert – evident – geen ‘homogene’ resultaten op. Er zijn wel aanwijzingen voor de mogelijkheid van verschillende pathologische mechanismen naar gelang het oorzakelijk virus. Zo speculeert men bv. over het feit dat een EBV-infektie een auto-immune respons kan triggeren.

Zelf blijven wij ook denken dat niet één enkel virus of infektueus agens verantwoordelijk is maar dat de gelijkenissen tussen bepaalde virale (bakteriële?) sequenties en lichaamseigen molekulen een auto-immuun probleem kan veroorzaken.

————————-

Frontiers in Medicine Vol 8, p 686736 (July 2021)

Herpesviruses serology distinguishes different subgroups of patients from the United Kingdom Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Biobank

Tiago Dias Domingues (1,2), Anna D Grabowska (3), Ji-Sook Lee (4), Jose Ameijeiras-Alonso (5), Francisco Westermeier (6,7), Carmen Scheibenbogen (8), Jacqueline M Cliff (4), Luis Nacul (9,10), Eliana M Lacerda (9), Helena Mourino (1,11), Nuno Sepulveda (2,4,8)

1 Departamento de Estatistica e Investigacao Operacional, Faculdade de Ciencias, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal.

2 CEAUL – Centro de Estatistica e Aplicacoes da Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal

3 Department of Biophysics, Physiology, and Pathophysiology, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland

4 Department of Infection Biology, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, United Kingdom

5 Department of Statistics, Mathematical Analysis and Optimization, Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain

6 Institute of Biomedical Science, Department of Health Studies, FH Joanneum University of Applied Sciences, Graz, Austria

7 Centro Integrativo de Biologia y Quimica Aplicada (CIBQA), Universidad Bernardo O’Higgins, Santiago, Chile

8 Institute of Medical Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt Universitat zu Berlin and Berlin Institute of Health, Berlin, Germany

9 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, United Kingdom

10 Complex Chronic Diseases Program, British Columbia Women’s Hospital and Health Centre, Vancouver, BC, Canada

11 CMAFcIO – Centre of Mathematics, Fundamental Applications and Operations Research, Faculdade de Ciencias, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal

Samenvatting

Het bewijsmateriaal omtrent een associatie tussen Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) en chronische herpesvirus-infekties blijft inconsistent. Twee redenen voor gebrek aan éénduidig bewijsmateriaal zijn de grote heterogeniteit in de patiënten-populatie met verschillende ziekte-triggers en het hanteren van willekeurige ‘cut-off’ [drempel] waarden voor het definiëren van sero-positiviteit. In dit werk voerden we een her-analyse uit van eerder gepubliceerde serologische gegevens betreffende 7 herpesvirus-antigenen. Patiënten met M.E./CVS werden onderverdeeld in vier subgroepen op basis van ziekte-triggers: S₀ – 42 patiënten die hun ziekte-trigger niet kenden; S₁ – 43 patiënten die een niet-infektueuze trigger rapporteerden; S₂ – 93 patiënten die een infektie-trigger rapporteerden maar waarvan de infektie niet werd bevestigd door een laboratorium-test; en S₃ – 48 patiënten die een infektie-trigger rapporteerden en waarvan de infektie werd bevestigd door een laboratorium-test. Overéénkomstig een sensitiviteit-analyse, werden de gegevens vergeleken met die van 99 gezonde controles waarbij de sero-positiviteit ‘cut-off’s mochten variëren binnen een breed bereik van mogelijke waarden. We vonden een negatief verband tussen S₁ en sero-positiviteit voor Epstein-Barr virus (VCA & EBNA1 antigenen) en Varicella-Zoster virus [waterpokken] gebruikmakend van een specifieke sero-positiviteit ‘cut-off’. Deze associatie bleek echter niet significant wanneer werd gecontroleerd voor ‘multiple testing’ [uitvoeren van meerdere statistische toetsen op dezelfde set gegevens; het gevaar hierbij is dat je vaker op basis van toeval een verschil zult vinden; corrigeren kan door een strenger significantie-niveau aan te houden (< 0.05).]. We vonden ook dat S₃ een lagere sero-prevalentie [frequentie van het voorkomen van antilichamen] had voor menselijk cytomegalovirus vergeleken met gezonde controles voor alle gebruikte sero-positiviteit ‘cut-off’s en na aanpassing voor ‘multiple testing’. Dit verband bleek echter niet statistisch significant bij gebruik van een andere procedure. Samengevat: herpesvirus-serologie kan subgroepen M.E./CVS-patiënten onderscheiden op basis van ziekte-trigger maar deze bevinding kan eventueel beïnvloed zijn door het probleem van ‘multiple testing’.

INLEIDING

[…] De ziekte-prevalentie van M.E./CVS werd op ca. 0,4% geschat op basis van de verzameling van gegevens van verschillende epidemiologische studies. Deze schatting kan echter als behoudend worden beschouwd omwille van de slechte herkenning van de ziekte door bijna alle gezondheid-professionals, het niet-bestaan van een objectieve ziekte-specifieke biomerker naar diagnose toe, het klein aantal goed-ontworpen epidemiologische studies en de beperkte mogelijkheden voor meer uitgebreide en integratieve research.

De etiologie en pathogenese van M.E./CVS blijft onderwerp van intense discussie, waarbij veel concurrerende hypotheses bestaan. Er bestaat echter een algemene consensus dat de ziekte geïnitieerd kan worden door een combinatie van genetisch voorbestemmende factoren en omgeving-triggers (bv. blootstelling aan toxinen, chronische emotionele en lichamelijke stress). In dit opzicht rapporteren een groot deel patiënten een acute infektie bij aanvang van hun symptomen. Herpesvirussen zoals Epstein-Barr virus (EBV) en het menselijk herpesvirus-6 (HHV6) worden als de voornaamste kandidaten beschouwd als oorzakelijke agentia voor M.E./CVS omwille van hun hoge prevalentie bij volwassenen en hun reaktivatie vastgesteld bij patiënten. Om de rol van deze virussen bij M.E./CVS te begrijpen, werden vele serologische onderzoeken uitgevoerd zonder overtuigend of zelfs met tegenstrijdige bevindingen [Rasa S et al. Chronic viral infections in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). J Transl Med. (2018) 16: 268]. Mogelijke redenen voor dit contrasterend bewijs kunnen verband houden met ziekte-misklassificatie en selektie-bias, de noodzaak om patiënten op te delen in verschillende subtypes, het laag aantal gerecruteerde patiënten of verschillen qua antigen en gebruikte experimentele testen. Een bijkomende maar dikwijls genegeerde reden is dat serologische studies typisch gebaseerd zijn op willekeurige ‘cut-off’ waarden voor het identificeren van seropositieve individuen of hoog-antilichaam responders, zoals werd geïllustreerd in twee serologische studies aangaande herpesvirussen [Loebel M et al. Serological profiling of the EBV immune response in Chronic Fatigue Syndrome using a peptide microarray. PLoS ONE. (2017) 12: e0179124 /// Blomberg J et al. Antibodies to human herpesviruses in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Front Immunol. (2019) 10: 1946].

De analyse van serologische gegevens afkomstig van de ‘United Kingdom M.E./CFS Biobank’ (UKMEB) vond geen associatie tussen M.E./CVS en de aanwezigheid van antilichamen tegen chronische infekties door verschillende herpesvirussen [Cliff JM et al. Cellular immune function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front Immunol. (2019) 10: 796]. Hier voerden we een her-analyse van deze gegevens uit na opdeling van de M.E./CVS-patiënten in vier subgroepen op basis van niet-infektueuze vs. infektueuze ziekte-triggers. We voerden ook een sensitiviteit-analyse uit aangaande het verband tussen M.E./CVS en elk herpesvirus in funktie van de sero-positiviteit definiërende ‘cut-off’.

MATERIALEN & METHODES

Studie-deelnemers

Deelnemers opgenomen in de UKMEB: 226 patiënten met M.E./CVS en 99 gezonde controles (HC). De grootte van het staal gezonde controles komt overéén met dat gebruikt voor andere serologische studies aangaande de rol van herpesvirussen bij M.E./CVS [zie Rasa S et al. hierboven]. Bij opname in de biobank dienden de patiënten vragenlijst in te vullen waar een specifieke vraag werd gesteld over het feit of ze een infektie hadden bij aanvang van de. Het antwoord op deze vraag leverde vier categorieën op die we gebruikten om de patiënten in subgroepen: op te delen S₀ – geen weet over infektie bij aanvang (n = 42; 18,5%); S₁ – geen infektie bij aanvang (n = 43; 18,9%); S₂ – infektie bij aanvang maar deze was niet bevestigd d.m.v. een laboratorium-test (n = 93; 41,0%); S₃ – infektie bij aanvang en deze was bevestigd d.m.v. een laboratorium-test (n = 48; 21,1%). Er werd de patiënten ook gevraagd te vertellen over de factoren die de ziekte zouden kunnen getriggerd hebben.

Leeftijd van de individuen: allemaal tussen 18 & 60 jaar. M.E./CVS […] diagnose volgens de 1994 ‘Centres for Disease Control and Prevention’ (CDC) of de 2003 ‘Canadian Consensus Criteria’. Deelnemers werden uitgesloten als ze anti-virale medicijnen namen die de immuun-funktie kunnen beïnvloeden tijdens de drie voorafgaande maanden. […].

Herpesvirus-serologie

[…]

ELISA-testen om de plasma-concentraties van IgG-antilichamen tegen de volgende virussen te kwantificeren: menselijk cytomegalovirus, EBV-VCA [‘viral capsid’ antigen = viruskapsel], EBV-EBNA1 [‘Epstein-Barr nuclear antigen 1’], herpes simplex virus-1 (HSV1), herpes simplex virus-2 (HSV2), Varicella-Zoster virus (VZV). De ELISA-VIDITEST werd gebruikt voor kwantificatie van IgG tegen HHV6. […] De stalen werden sero-positief beschouwd bij concentratie ≥ 12 U/ml voor HSV1, HSV 2, VZV, CMV & EBV antigenen; voor HHV6 ≥ 12,5 U/ml.

Statistische analyse

[…]

We voerden eerder grondige analyses uit omtrent verschillende ‘cut-off’ waarden voor sero-positiviteit van elk viraal antigen [Domingues TD et al. A statistical analysis of serological data from the UK Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome BioBank. AIP Conference Proceedings 2293: 420099]. Deze waren gebaseerd op de vergelijking en de selektie van verschillende gemengde maatstaven voor scheefgetrokken/normale distributies en vier verschillende criteria om sero-positiviteit te definiëren. Overéénkomstig een sensitiviteit-analyse, in plaats van het selekteren van een vaste ‘cut-off’, lieten we hier toe dat deze ‘cut-off’ varieert tussen 10 U/ml en 100 U/ml […]. Voor elke ‘cut-off’ van een bepaald antilichaam, schatten we eerst de niet-aangepaste sero-positiviteit ‘odds ratio’ (OR [statistische waarde die de sterkte van een verband tussen twee gebeurtenissen kwantificeert; bij een OR = 1 zijn de gebeurtenissen onafhankelijk, bij OR > 1 zijn ze geassocieerd, bij OR < 1 zijn ze negatief gecorreleerd.]) en de ‘area under the Receiver Operating Characteristic curve’ (AUC) [indicatie voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// ‘area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0,90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0,80-0,90 is goed] van elke M.E./CVS-subgroep t.o.v. de gezonde controles (regressie-model waarbij sero-positiviteit van de individuen en een groep-indicator respectievelijk de uitkomst en de co-variabele zijn).

We pasten deze ORs & AUCs dan aan gebruikmakend van een gelijkaardig regressie-model met in acht name van leeftijd, en een groep-indicator variabele als co-variabelen. In beide aangepaste en niet-aangepaste analyses, werd het effekt van gezonde controles als referentie voor de groep-indicator variabele gesteld. We berekende de p-waarden […] om de significantie […] te bepalen voor elke M.E./CVS-subgroep t.o.v. de gezonde controles. De significantie-werd vastgelegd op 5%. […]

Om de impact van ‘multiple testing’ op de resultaten te onderzoeken, pasten we de onbewerkte p-waarden […] aan om een ‘false discovery rate’ [FDR, aantal vals positieve resultaten] van 5% te verzekeren. Daartoe gebruikten we […] procedures waarbij, respectievelijk, onafhankelijke en positief gecorreleerde testen worden verondersteld […]. Bij deze analyse waren aangepaste p < 0.05 indicatief voor statistisch significante verbanden.

Ten slotte schatten we de statistische ‘power’ van de gevonden associaties […]. Voor elk antilichaam gebruikten we het volgend algoritme: (a) bepalen van de optimale sero-positiviteit ‘cut-off’ […]; (b) genereren van sero-positiviteit gegevens op basis van de optimale ‘cut-off’; (c) opmaken van een model met de groep-indicator als enige co-variabele (niet-aangepaste analyse) of een model met inclusie van leeftijd, geslacht en groep-indicator variabelen als co-variabelen (aangepaste analyse) […]; (d) berekenen van de ‘power’ van de associatie tussen sero-positiviteit en elke studie-groep […].

[…]

RESULTATEN

Karakterisatie van de studie-deelnemers

De vier M.E./CVS-subgroepen hadden ongeveer dezelfde leeftijd-verdeling (p = 0.30; gemiddelden 44,6 – 40,7 – 43,3 -40,9 jaar). De respectievelijke gemiddelde leeftijd bij ziekte-aanvang was 32,1 – 30,2 – 31,3 – 27,3; de gemiddelde ziekteduur was 12,7 – 11,6 – 12,1 – 13,5. De verschillen voor deze variabelen waren niet statistisch significant (p = 0.55 & 0.21, respectievelijk). Het percentage vrouwelijke patiënten varieerde tussen 70,8% en 80,6% (niet statistisch verschillend, p = 0.62).

Het percentage ernstig aangetaste patiënten verschilde significant voor de subgroepen (p = 0.003). Het percentage dergelijke patiënten in S₀ & S₁ was ca. 9% en was duidelijk anders dan de 30% ernstig aangetaste patiënten in S₂ & S₃ (de groepen gerelateerd met infektie-triggers).

Wat betreft het aantal aangegeven ziekte-factoren of -triggers: subgroep S₁ had het laagste percentage patiënten die één factor of trigger rapporteerden (44%), vergeleken met S₂ & S₃ (56 & 67%, respectievelijk). Dezelfde subgroep vertoonde het hoogste percentage ontbrekende gegevens voor deze vraag (33% voor S₁ vs. 6 & 10% voor S₂ & S₃, respectievelijk). De verdeling van het aantal gerapporteerde ziekte-factoren of -triggers was significant verschillend tussen S₁, S₂ & S₃ (p < 0.001) […].

De subgroepen M.E./CVS-patiënten waren goed gematcht qua geslacht en leeftijd met de gezonde controles […].

Ziekte-factoren of triggers aangegeven voor verschillende M.E./CVS-patiënten

Van de 184 patiënten van S₁, S₂ & S₃ rapporteerden 56% & 30% één of meerdere factoren (of triggers). 14% maakte geen melding van enige specifieke trigger/factor. In totaal werden 14 afzonderlijke categorieën ziekte-triggers aangegeven (consistent met deze gerapporteerd in eerdere epidemiologische studies.

De volgende niet-infektueuze factoren/triggers vermeld voor subgroep S₁: stress – onderverdeeld in algemene angst (9%, n = 20), persoonlijke (8%, n = 18) of beroepsmatige stress (5%, n = 11); ongevallen/letsels/operaties (5%, n = 11); zwangerschap, geboortes en andere problemen gerelateerd met vrouwelijke reproductie (3%, n = 6) en andere niet-infektueuze. De overblijvende factoren waren gerelateerd met microbiële infekties en/of infektueuze ziekten: infekties van de bovenste luchtwegen – klierkoorts, tonsillitis, EBV-infekties of keelontsteking (21%, n = 48); infekties van de onderste luchtwegen – pneumonie (4%, n = 10); griep- of verkoudheid-achtige ziekten (11%, n = 26); gastro-intestinale problemen en gerelateerde infekties (4%; n = 9); en tropische infektueuze ziekten – dengue [knokkelkoorts; virale infektie] & schistosomiase [bilharzia; infektie met parasitaire Schistosoma-wormen] (1%, n = 3); en andere virale of bakteriële infekties, en niet-gespecificeerde infekties (22%, n = 51). […]

Analyse van de serologische gegevens per subgroep M.E./CVS-patiënten

Bij de vergelijking van de serologische gegevens van de M.E./CVS-subgroepen met de gezonde controles was het de bedoeling de impact van de ‘cut-off’ op de resulterende sero-positiviteit te onderzoeken voor elke M.E./CVS-subgroep en HCs.

De ongecorrigeerde analyse leverde in de meeste gevallen AUCs tussen 0,50 & 0,60 op. Deze bevinding suggereert dat de serologische gegevens een beperkte voorspellende waarde hadden om de sero-positiviteit van de M.E./CVS-subgroepen te onderscheiden van gezonde controles. De hoogste AUC was ca 0,75 voor VZV (vergelijking van de sero-positiviteit van S₂ met HCs op basis van ‘cut-off’s onder 15 U/ml).

Op basis van ‘odds ratio’-schattingen konden we geen significant verband van S₀ & S₂ met herpesvirus-serologie vinden. De enige uitzondering was een vermoedelijke associatie tussen S₀ en antilichamen tegen EBV-VCA (‘cut-off’ 37 U/ml). Interessant: vóór ‘multiple testing’ correctie, vonden we significant negatieve verbanden […] tussen S₁ en antilichamen tegen EBV-VCA, EBV-EBNA1 & VZV afhankelijk van de gebruikte ‘cut-off’. Deze negatieve associaties suggereren gedaalde sero-prevalenties voor deze herpesvirussen in deze subgroep vergeleken met de gezonde controles. Na controleren voor ‘multiple testing’ bleken deze verbanden niet statistisch significant […].

We vonden ook een significant negatieve associatie tussen S₃ & CMV sero-positiviteit, wat gedaalde antilichaam-waarden in deze subgroep in t.ov. gezonde controles suggereert. De corresponderende AUC bleek ca. 0,65 voor de meeste ‘cut-off’s. Dit verband was consistent voor de ‘cut-off’s gespecificeerd voor de analyse en zelfs na controleren voor ‘multiple testing’ […]. De statistische significantie verdween echter bij aanwenden van een andere statistische procedure.

Er werden gelijkaardige bevindingen verkregen bij aanpassing voor mogelijke verstorende effekten van leeftijd en geslacht. Deze overéénkomst tussen niet-aangepaste en aangepaste analyses kan worden verklaard door een goeie matching tussen de verschillende M.E./CVS-subgroepen en gezonde controles in termen van leeftijd en geslacht. De significantie van aangepaste ‘odds ratio’s was echter lichtjes lager door deze vermoedelijke verstorende factoren.

Tenslotte hebben we de statistische ‘power’ met betrekking tot de geïdentificeerde associaties geschat gerbuikmakend van de optimale sero-positiviteit ‘cut-off’ voor elk herpesvirus-antilichaam. Wat betreft de niet-aangepaste analyse varieerden deze optimale ‘cut-off’s van 11 U/ml tot 90 U/ml. Er werden gelijkaardige optimale ‘cut-off’s verkregen voor de analyse aangepast voor leeftijd en geslacht, met uitzondering van EBV-EBNA1 (waar de optimale ‘cut-off’s 72 U/ml & 88 U/ml waren, niet-aangepast en aangepaste analyses, respectievelijk). De maximale ‘power’ (ca. 90%) werd bekomen voor het verband tussen CMV sero-positiviteit en M.E./CVS-subgroep S₃ (niet-aangepaste en aangepaste analyses). Er werd ook een hoge ‘power’ (ca. 75%) verkregen voor de associaties tussen VZV sero-positiviteit en M.E./CVS-subgroep S₁. De resterende verbanden tussen elke studie-groep en herpesvirus sero-positiviteit had een ‘power’ die de 60% niet oversteeg. Tot besluit: de sero-positiviteit ‘cut-off’s opgegeven door de fabrikant bleken niet de meest adequate om de kans voor het vinden van een associatie te maximaliseren tussen M.E./CVS-subgroepen en herpesviruses-serologie, en slechts drie verbanden tussen de studie-groepen en herpesvirus sero-positiviteit had een voldoende statistische ‘power’.

BESPREKING

In tegenstelling tot de oorspronkelijke studie waar we geen verschillen verbonden met herpesvirus-serologie konden vinden tussen gezonde controles en M.E./CVS-patiënten opgedeeld volgens ziekte-ernst [zie Cliff JM et al. hierboven], identificeerde onze her-analyse van dezelfde gegevens twee subgroepen M.E./CVS-patiënten (S₁ & S₃) waarbij dergelijke verschillen nu statistisch significant bleken. Deze nieuwe bevinding was enkel mogelijk door de stratificatie van patiënten op basis van een vraag over het voorkomen van een infektie bij ziekte-aanvang tesamen met een sensitiviteit-analyse van de aangewende sero-positiviteit ‘cut-off’. De stratificatie of subtypering van de patiënten werd uitgevoerd overéénkomstig aanbevelingen voor M.E./CVS-research. We voerden eerder een immunologisch onderzoek uit gebaseerd op een stratificatie van M.E./CVS-patiënten volgens de ernst van hun symptomen. Via deze stratificatie toonden we verstoringen in het T-cel compartiment, namelijk wat betreft effector CD8+ T-cellen en de mucosa-geassocieerde invariante T-cellen. In een andere studie (gelijkaardige stratificatie) met stalen van de UKMEB, bleken de waarden van de cellulaire stress biomerker GDF15 verhoogd bij ernstig aangetaste patiënten op verschillende tijdstippen [Melvin A et al. Circulating levels of GDF15 in patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2019) 17: 409]. We speculeren dat andere immunologische verstoringen gedetekteerd zouden kunnen worden als onze alternatieve stratificatie gebruikt zou worden. Dit onderzoek zal in de toekomst worden uitgevoerd.

Overéénkomstig onze bevindingen dook bewijsmateriaal op voor het feit dat het voorkomen van een acute infektie bij aanvang van de ziekte-symptomen inderdaad een belangrijke stratificerende factor is om genetische en immunologische verschillen te detekteren tussen subgroepen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles [Szklarski M et al. Delineating the association between soluble CD26 and autoantibodies against G-protein coupled receptors, immunological and cardiovascular parameters identifies distinct patterns in post-infectious vs. non-infection-triggered Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Front Immunol. (2021) 12: 1077]. De simplistische benadering van het opdelen van patiënten volgens niet-infektueuze en infektueuze triggers zou echter onvoldoende kunnen zijn om relatief homogene subgroepen M.E./CVS-patiënten te verkrijgen, wat de statistische ‘power’ om ziekte-specifieke effekten te detekteren aantast. Naast de beperkte keuze aan antilichamen tegen verschillende herpesvirus-gerelateerde antigenen, lijkt de grote heterogeniteit qua infektie-triggers een mogelijke verklaring voor het ontbreken van een associatie tussen subgroep S₂ en herpesvirus sero-positiviteit. Ondanks het feit dat de infektie-trigger niet in het lab werd bevestigd, rapporteerden patiënten van deze subgroep het meest griep-achtige ziekten, die veroorzaakt zou kunnen geweest zijn door het influenza-virus, het rinovirus of het respiratoir syncytieel virus [RSV]. Het is dus denkbaar dat deze patiënten verschillende pathologische mechanismen voor M.E./CVS vertonen naar gelang het oorzakelijk virus, waarvan sommige zonder enige directe impact op de antilichaam-responsen tegen herpesvirussen. Om deze problemen te overwinnen, bevelen we aan om infektie-trigger gegevens zo gedetailleerd en accuraat mogelijk te verzamelen.

Onze meest consistente associatie werd verkregen tussen CMV sero-positiviteit en patiënten van subgroep S₃. Deze patiënten hadden de neiging minder sero-positief te zijn voor dit herpesvirus vergeleken met gezonde controles, ongeacht de gebruikte sero-positiviteit ‘cut-off’. Eerder leverden verschillende serologische onderzoeken geen éénduidig bewijs voor de rol van CMV bij M.E./CVS-pathogenese [zie Rasa S et al. hierboven]. Het gebrek aan of het aanwenden van een inadequate stratificatie kan deze eerdere bevindingen ook verklaren. In dit opzicht werd de onthulde associatie verkregen in een subgroep waar de nauwkeurigheid van de rapportering het hoogst zou kunnen zijn, omdat de ziekte-triggererende infekties zogezegd bevestigd werden in het lab. We kunnen echter het feit niet negeren dat deze subgroep een groot deel patiënten omvat waarvan de ziekte-trigger gerelateerd was met een EBV-infektie, één van de meest gerapporteerde oorzakelijke agentia voor M.E./CVS. Daarom is het mogelijk dat onze bevinding het resultaat was van een samenloop tussen een lage-resolutie patiënten-stratificatie en een willekeurige aanrijking van een specifieke infektie-trigger in één van de subgroepen.

Een vermoedelijk gedaalde sero-positiviteit (of antilichaam-waarden) voor CMV bij een EBV infektie-trigger zou verklaard kunnen worden door een de hyper-regulering hypothese [Sepulveda N et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome as a hyper-regulated immune system driven by an interplay between regulatory T cells and chronic human herpesvirus infections. Front Immunol. (2019) 10: 2684: “milde infekties zouden kunnen leiden tot chronisch geaktiveerde immuun-responsen onder controle van Tregs als de reagerende kloon een hoog auto-immuun potentieel heeft; dergelijke infekties bevorderen persistente inflammatie en mogelijks vermoeidheid”]. Volgens deze hypothese is een mogelijk pathologisch mechanisme voor M.E./CVS gerelateerd met een expansie van regulerende CD4+ T-cellen (Tregs) [zie ook:‘Verstoring van effector & regulerende T-cel subsets bij M.E.(cvs)’] aangestuurd door een auto-immune respons tegen een viraal antigen dat een ‘self’-antigen nabootst. [lees ook: ‘‘Molecular mimicry’, auto-immuniteit & infektie’] Deze expansie van Tregs na herpesvirus-infektie of reaktivatie vergrendelt het (adaptief) immuunsysteem in een aktieve toestand van hyper-regulering waarbij verschillende infekties moeilijker kunnen worden opgeruimd uit het lichaam. Frequente infekties worden wel degelijk gemeld door M.E./CVS-patiënten. De vraag is dan hoe de expansie van Tregs de antilichaam-responsen tegen CMV kan beïnvloeden. De zogenaamde follikulaire Tregs zouden het antwoord op deze vraag kunnen omvatten. Deze gespecialiseerde Tregs zijn afgeleid van Treg-voorlopers met het vermogen om te migreren naar ‘germinal centre reactions’ (GCRs [basis voor T-cel afhankelijke humorale immuniteit tegen pathogenen, gebaseerd op de samenwerking tussen antigen-specifieke B cellen, T follikulaire helper cellen en follicklaire dendritische cellen]) om de respectievelijke antilichaam-produktie en antilichaam-maturatie te inhiberen. In het bijzonder: experimenten bij dieren-modellen toonden aan dat de hoeveelheid IgG-antilichamen tegen verschillende vreemde antigenen verhoogd is in geïmmuniseerde muizen zonder follikulaire Tregs. Overéénkomstig hiermee is het redelijk om te veronderstellen dat een gestegen aandeel Tregs bij M.E./CVS vertaald kan worden naar een gestegen aandeel of follikulaire Tregs. Deze toename kan op z’n beurt de antilichaam-produktie aangestuurd door GCRs verhogen. We kunnen dan hypothiseren dat een EBV-infektie een auto-immune respons triggert die het normaal evenwicht tussen Tregs en effector CD4+ T-cellen ontwricht; een peptide van het viraal EBNA6 [Epstein-Barr nucleair antigen 6] bleek een hoge sequentie-homologie te vertonen met menselijk lactoperoxidase [antibakterieel & antiviraal enzyme] en thyroïd-peroxidase [schildklier-prohormoon] [zie Loebel M et al. hierboven]. De ontwrichting van dit evenwicht kan leiden tot een toename van natuurlijke én follikulaire Tregs. Een mogelijk gevolg van deze toename is een verminderde antilichaam-produktie tegen een latere CMV-infektie of -reaktivatie. Merk op dat meerdere peptiden van CMV ook werden gevonden als vermoedelijke kandidaten voor ‘molecular mimicry’ [zie hierboven] met menselijke proteïnen. Vergelijkbaar met de situatie bij immunosuppressie, kan een reductie qua humorale immuniteit tegen CMV M.E./CVS-patiënten vatbaarder maken voor een mogelijke reaktivatie van dit virus. Het is het vermelden waard dat de rol van follikulaire Tregs nog niet is onderzocht bij M.E./CVS-patiënten.

Een andere interessante bevinding is het mogelijk verband tussen subgroep S₁ en EBV & VZV sero-positiviteit. Deze subgroep verwijst naar patiënten die niet-infektueuze triggers rapporteerden, meestal gerelateerd met stressvolle of stress-gerelateerde gebeurtenissen. Het is ook een groep waar M.E./CVS bij veel vrouwen was getriggerd door problemen tijdens en na zwangerschap, moeilijke bevalling of aandoeningen gerelateerd met de vrouwelijke reproductie. Overéénkomstig deze bevinding verhogen stressvolle omstandigheden en gebeurtenissen, zoals deze die worden ervaren door astronauten, de kans op herpesvirus-reaktivatie, specifiek EBV, VZV & CMV. Reaktivatie van latente herpesvirus-infekties kunnen worden verklaard door een toename van de aanmaak van stress-gerelateerde hormonen samen met een signatuur van inflammatoire cytokinen die het immuunsysteem verzwakken. Er wordt dan verwacht dat deze subgroep een hogere prevalentie qua aktieve herpesvirus-infekties heeft dan de resterende subgroepen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Gezien het feit dat deze subgroep < 50% van de patiënten kan vertegenwoordigen, is het waarschijnlijk dat die onvoldoende statistische ‘power’ heeft om verschillen qua herpesvirus-reaktivatie tussen M.E./CVS en gezonde controles te detekteren, zelfs in het geval van een gepaste stratificatie van de patiënten-populaties. Deze beperking is een bijkomende reden die de inconsistente bevindingen omtrent herpesvirus-reaktivatie in veel M.E./CVS-studies kan verklaren.

We vonden geen associatie tussen subgroep S₀ en herpesvirus sero-positiviteit. Deze subgroep vertegenwoordigde 18,5% van de patiënten-groep, een waarde die compatibel is met de percentages van patiënten die geen ziekte-triggerende gebeurtenis meldden in eerdere epidemiologische studies [10% – 24%]. De grootte van deze subgroep was niet zeer omvangrijk en daarom kunnen we niet uitsluiten dat het ontbreken van verbanden hier simpelweg te wijten is aan onvoldoende statistische ‘power’ om vermoedelijke verbanden tussen deze subgroep en herpesvirus sero-positiviteit te detekteren.

In onze associatie-analyse mocht de sero-positiviteit ‘cut-off’ variëren binnen een bepaald waarden-bereik, zoals werd gedaan in een studie omtrent ‘molecular mimicry’ tussen Anoctamine-2 [ionkanaal] & EBNA1 bij Multipele Sclerose. Deze analytische benadering lijkt redelijk gezien de moeilijkheid wat betreft het kiezen van de beste sero-positiviteit ‘cut-off’ […], zoals werd geïllustreerd bij de eerdere analyses van dezelfde gegevens. Deze benadering komt ook overéén met meerdere besprekingen over sero-positiviteit schattingen en de gevoeligheid van het aanwenden van een vaste ‘cut-off’. Variatie qua ‘cut-off’s die de sero-positiviteit definiëren zouden echter de kans op vals-positieven kunnen verhogen omwille van de ‘multiple testing’ kwestie. We probeerden het probleem te overwinnen door controle van de ‘false discovery rate’, maar de beperkte grootte van elke M.E./CVS-subgroep liet niet toe statistische significantie van de gevonden verbanden te bereiken als we een procedure gebruikten die gebaseerd is op de veronderstelling van meerdere positief gecorreleerde testen. Anderzijds suggereerden onze ‘power’-berekeningen een hoge waarschijnlijkheid voor het detekteren van enkele van de associaties bij de veronderstelling dat ze feitelijk waar zijn. Daarom dient de correcte toepassing van ‘cut-off’ variatie een grondige beoordeling van een vermoedelijk ‘multiple testing’ probleem te omvatten, samen met een ‘power’-berekeningen ten einde de statistische consistentie van de bevindingen te beoordelen.

Als finale opmerking dienen we te noteren dat ‘cut-off’s voor het detekteren van associaties tussen herpesvirussen en M.E./CVS kunnen variëren tussen laboratoria en gebruikte serologie-testen. Daarnaast is het mogelijk dat een hoge ‘cut-off’ voor de gegevens sero-positiviteit niet per se definieert, maar eerder een hoge antilichaam-respons waarvan de detektie het primair objectief van de analyse kan zijn. Het gebruiken van een hoge ‘cut-off’ is ook in overéénstemming met een benadering waar sero-positiviteit wordt onderverdeeld in verschillende waarden. Daarom lijkt onze sensitiviteit-achtige benadering het vermogen te hebben verdere serologische verbanden te detekteren buiten deze gebaseerd op de klassieke sero-prevalentie. Een dergelijk vermogen kan de kans op het bereiken van wetenschappelijke reproduceerbaarheid te verhogen. We bevelen het routinematig gebruik van deze benadering aan bij toekomstige serologische onderzoeken bij M.E./CVS.