In ‘Neuro-inflammatie en cytokinen bij M.E.(cvs)’ beklemtoonde VanElzakker (nogmaals) het belang van de hersenstam en de nervus vagus. De auteurs van onderstaand artikel laten ook optekenen dat de hersenstam, waar de nervus vagus ontspringt, vermoedelijk een ‘brandpunt’ in de pathogenese van M.E.(cvs) is.

In ‘Het Cholinergisch Anti-inflammatoir Mechanisme’ bespraken we al kort de zgn. inflammatoire reflex, de theorie dat stimulatie van de nervus vagus mogelijks een defekte inflammatoire respons zou kunnen blokkeren (door te zorgen dat het immuunsysteem stopt met het afgeven van inflammatoire merkers).

Stimulatie van de nervus vagus kan via geïmplanteerde (elektrische) stimulators maar er zijn ook niet-invasieve stimulators die gebruik maken van mechanische stimulatie van zenuw-uiteinden in het oor of op de nek. Een team van het Zweedse Karolinska Instituut onderzocht het effekt van Intranasale Mechanische Stimulatie (INMEST) op de symptomen van M.E.(cvs). Dit zou de nervus vagus kernen in de hersenstam stimuleren en de inflammatoire reflex triggeren. Dit levert hier een vermindering van 30% van de globale symptomen na acht weken…

Prof. Jan-Erik Juto (één van de mede-auteurs van onderstaand artikel) is een pionier van INMEST. Het wordt toegediend d.m.v. een zachte en plooibare katheter die in de neusholte wordt ingebracht en zachtjes de dieper gelegen weefsels stimuleert. De technologie wordt verder onderzocht in klinische proeven. Het bedrijf Abilion Medical Systems AB (waarvan Juto de oprichter is) ontwikkelt een apparaatje dat INMEST beschikbaar zou maken voor “zelf-behandeling” thuis. Er zijn patenten aangevraagd…

————————-

BioRiv (Pre-print februari 2020)

Achieving symptom relief in patients with Myalgic Encephalomyelitis by targeting the neuro-immune interface and inducing disease tolerance

Lucie S.T. Rodriguez (1), Christian Pou (1), Tadepally Lakshmikanth (1), Jingdian Zhang (2,3), Constantin Habimana Mugabo (1), Jun Wang (1), Jaromir Mikes (1), Axel Olin (1), Yang Chen (1), Joanna Rorbach (1,4), Jan-Erik Juto (5), Tie Qiang Li (5,6), Per Julin (7,8), Petter Brodin (1,4)

1 Science for Life Laboratory, Department of Women’s and Children’s Health, Karolinska Institutet, SE-17121, Sweden

2 Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, SE-17176, Sweden

3 Max Planck Institute Biology of Ageing – Karolinska Institutet Laboratory, Karolinska Institutet, SE-17176, Sweden

4 Unit of Pediatric Rheumatology, Karolinska University Hospital, SE-17176, Sweden

5 Department of Clinical Sciences, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, SE-17177, Sweden

6 Department of Medical Radiation and Nuclear Medicine, Karolinska University Hospital, Sweden

7 Department of Neurobiology, Care Sciences and Society, Karolinska Institutet, SE-17176, Sweden

8 Neurological Rehabilitation Clinic, Stora Skondal, Skondal, Sweden, SE-12864, Sweden

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis, M.E., eerder ook gekend als Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een heterogeen, uitputtend syndroom met onbekende etiologie, verantwoordelijk voor langdurige invaliditeit bij miljoenen patiënten wereldwijd. Het best bekende symptoom van M.E. is post-exertionele malaise, maar veel patiënten ondervinden ook autonome ontregeling, craniale zenuw dysfunktie en tekenen van immuunsysteem-aktivatie. Veel patiënten maken ook melding van een plotse aanvang van de ziekte na een infektie. De hersenstam is een vermoedelijk focaal punt in de M.E.-pathogenese en patiënten met strukturele stoornissen van de hersenstam vertonen dikwijls M.E.-achtige symptomen. De hersenstam is ook waar de nervus vagus ontspringt, een cruciale neuro-immune interface en mediator van de inflammatoire reflex [ook ‘het cholinergisch anti-inflammatoir mechanisme’ genoemd; zie link in onze inleiding] die systemische inflammatie reguleert. Hier rapporteren we de resultaten van een gerandomiseerde, placebo-gecontroleerde proef gebruikmakend van intranasale mechanische stimulatie (INMEST) gericht op de nervus vagus kernen, en hogere centra in de hersenen van M.E.-patiënten wat een duurzame, ~30% reductie qua scores voor globale symptomen na acht weken behandeling induceerde. Door longitudinale monitoring op systeem-niveau van het bloed-immuunsysteem bij deze patiënten, leggen we chronische immuun-aktivatie bij M.E. bloot, alsook immunologische correlaten voor verbetering die zich rond de IL-17 as [interleukine-17 beschermt oppervlakten (bv. huid, darmwand-bekleding) tegen bakterieën en speelt een kritieke rol bij chronische intestinale inflammatie], darm-immuuncellen en verminderde inflammatie situeren. De mechanismen voor symptoom-verlichting dienen nog te worden bepaald, maar transcriptie-analyses suggereren een upregulering van ziekte-tolerantie mechanismen. We hopen dat deze resultaten enige hoop bieden aan patiënten lijdend aan M.E. en researchers inspireren onze nieuwe hypothese – dat M.E. een aandoening is die wordt veroorzaakt door een falende inductie van ziekte-tolerantie na infektie en persistente immuun-aktivatie – te helpen testen.

Inleiding

[…] Het is nu duidelijk dat M.E. een biologische basis heeft maar de ziekte is zeer heterogeen met variabele ernst en duur, wat het uitdagend maakt om te bestuderen. Eén van de meest opmerkelijke kenmerken van M.E. is de post-exertionele malaise die leidt tot significante verergering van de symptomen na mentale of fysieke aktiviteit boven een individuele drempel die dikwijls zeer laag ligt. Er wordt courant een betrokkenheid van het immuunsysteem gezien en veel patiënten ontwikkelen M.E. na een acute infektie of virus-reaktivatie, en meerdere studies hebben verhoogde merkers voor inflammatie bij M.E.-patiënten gerapporteerd. Sommige cytokinen correleren met ziekte-ernst en een grote studie (bijna 200 M.E.-patiënten) vond verschillen qua T-cel subset samenstelling en funktie in vergelijking met gezonde individuen [Karhan E et al. Perturbation of effector and regulatory T cell subsets in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS), Biorxiv (2019) 12.23.887505]. Ons vermogen om menselijke immuunsystemen te profileren, is verbeterd door de komst van hoog-dimensionale analyse-methodes zoals massa-cytometrie [cellen worden gelabeld met gezuiverde metaal-ionen als unieke merkers voor antilichamen, en gedetekteerd/gekwantificeerd d.m.v. een massa-spectrometer], plasma-proteomica en ‘single-cell’ genomica. Dergelijke methodes laten toe alle immuuncellen, en veel proteïnen en genen simultaan te bekijken, en onderling gereguleerde kenmerken te beschrijven. Dergelijke immunologie-studies bij gezonde individuen hebben aangetoond dat menselijke immuunsystemen ongelooflijk variabel zijn tussen individuen maar zeer stabiel binnen een individu met verloop van tijd en de meeste van deze variatie is toe te schrijven aan niet-erfelijke factoren. Analyses op systeem-niveau bieden ook verhoogde resolutie om verschillen te detekteren qua cel-, proteïne- en gen-combinaties geassocieerd met ziekte. Dit wordt duidelijk bij het uitvoeren van longitudinale profilering d.m.v. immuno-monitoring op systeem-niveau aangezien verstoringen geassocieerd met een ziekte-proces of respons op een behandeling duidelijk worden, en dikwijls zouden dergelijke patronen niet zichtbaar zijn geworden met reductionistische analyses [beschrijving van een complex fenomeen in termen van meer eenvoudige of fundamentele delen] of individuele immununsysteem-componenten alleen.

Een ander klinisch kenmerk van M.E. is autonome ontregeling, d.i. dysautonomie, met stoornissen van de bloeddruk-regulering, temperatuur-regulering, intestinale funktie en een waaier aan andere centrale lichaamsfunkties. Gezien de vergezellende immune en autonome stoornissen bij M.E. is het denkbaar dat een gemeenschappelijke verantwoordelijke de neuro-immune interface zou kunnen zijn. De meest opmerkelijke van dergelijke interfaces is de inflammatoire reflex [zie inleiding], een goed-gekende anti-inflammatoire reflex gemedieerd door de nervus vagus (Tracey KJ, The inflammatory reflex, Nature (2002) 420: 853-9 [zie ‘Het Cholinergisch Anti-inflammatoir Mechanisme’]). Directe infektie van nervus vagus vezels werd gesuggereerd als een mogelijk pathogeen mechanisme bij M.E. [VanElzakker MB et al. Neuroinflammation and Cytokines in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): A Critical Review of Research Methods, Frontiers in Neurology (2019) 9: 1033] en sommige patiënten met cervicale compressie [samendrukking van de halswervels] waarbij de vagus nucleus betrokken is, hebben M.E.-achtige symptomen, wat soms omkeerbaar is d.m.v. decompressie-chirurgie [Rowe PC et al. Improvement of severe Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome symptoms following surgical treatment of cervical spinal stenosis, Journal of Translational Medicine (2018) 16:21; zie ook ‘Halswervel-stenose als mogelijke oorzaak van ernstige M.E.(cvs) & orthostatische intolerantie’]. Bovendien kunnen afferente vezels in de nervus vagus microbiële stimuli en dysbiose in de darm en elders (die de chronische inflammatie bij M.E. voeden) voelen [Proal A & Marshall T. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome in the era of the human microbiome: Persistent pathogens drive chronic symptoms by interfering with host metabolism, gene expression and immunity, Frontiers in Pediatrics (2018) 6: 373].

Er zijn meerdere behandeling-modaliteiten gericht op de nervus vagus: geïmplanteerde elektrische zenuw-stimulators voor patiënten met ernstige epilepsie, alsook niet-invasieve stimulators die gebruik maken van mechanische stimulatie van mechano-sensitieve zenuw-uiteinden in het oor of op de nek, die de nervus vagus kernen in de hersenstam kunnen stimuleren en de inflammatoire reflex triggeren. Alternatieve behandeling-modaliteiten – Intranasale Mechanische Stimulatie (INMEST) en de verwante Kinetische Oscillatorische Behandeling (KOS) – gebruiken mechano-stimulatie om zenuw-uiteinden in de neusholte (die signalen propageren naar de nervus vagus kernen in de hersenstam) te triggeren. Merkwaardig genoeg heeft het gebruik van deze behandelingen bij patiënten met acute migraine en chronische inflammatoire aandoeningen een demping van systemische inflammatie aangegeven. Funktionele MRI bij gezonde vrijwilligers behandeld met INMEST toont verhoogde aktiviteit in de nervus vagus kernen maar het effekt op hartslag-variabiliteit, een indicatie voor de autonome regulering en het evenwicht tussen sympathische en parasympathische tonus, verschilt tussen deze vagus-stimulerende behandelingen.

Hier redeneerden we dat het gebruik van INMEST bij M.E. symptoom-verlichting zou kunnen induceren op een gelijkaardige manier als bij andere inflammatoire aandoeningen. Ook: door het uitvoeren van longitudinale immuno-monitoring op systeem-niveau bij behandelde patiënten, hoopten we de mechanismen die verstoord zijn bij M.E. beter te begrijpen door het monitoren van veranderingen die geassocieerd zijn met behandel-responsen en mogelijke symptoom-verlichting. We voerden een placebo-gecontroleerde, dubbel-blinde, gerandomiseerde proef uit waarbij tweewekelijks gedurende 8 weken INMEST werd toegediend. De klinische verbetering was significant beter met aktieve INMEST dan met placebo en vertegenwoordigde een ~30% reductie qua symptoom-intensiteit na 8 weken. We vonden ook meetbare veranderingen qua immune parameters die verstoringen suggereren waarbij IL-17 gemedieerde inflammatie, immuuncel energie-metabolisme en een falen om ziekte-tolerantie te induceren als elementen van M.E.-pathogenese zijn betrokken. Deze resultaten suggereren nieuwe manieren van mechanistisch onderzoek aangaande de ziekte en dat INMEST een eenvoudige en veilige methode is voor symptoom-verlichting via een her-calibratie van de neuro-immune referentie.

Resultaten

Verlichting van M.E.-symptomen na INMEST-behandeling

We namen 31 patiënten met matige tot ernstige M.E. [23 vrouwen, mediane leeftijd 42 (19-62), & 8 mannen, mediane leeftijd 35 (26-66)] op in de studie. Ze voldeden allemaal aan de Canadese consensus criteria. Deze individuen werden willekeurig verdeeld over de twee armen van een dubbel-blinde, gerandomiseerde proef waar ze 20 minuten INMEST toegediend kregen twee maal per week gedurende 1 maand, of placebo-behandeling die voor de patient of de arts niet te onderscheiden is van de aktieve INMEST. Dit is belangrijk om bias aangaande de patient/dokter-relatie te vermijden. Na de eerste maand placebo- of aktieve behandeling, kregen alle individuen aktieve INMEST-behandeling (tweewekelijks 20 minuten). Het INMEST-apparaat bestaat uit een dunne plastieken sonde die in de neus wordt geplaatst en die vibreert op een vastgelegde frequentie om een turbulente airflow in de neusholte na te bootsen en een zenuw-reflex te induceren die wordt doorgegeven aan de nervus vagus kernen in de hersenstam en andere hogere centra. Het is belangrijk op te merken dat het effekt van INMEST op de nervus vagus verschilt van dat van klassieke nervus vagus stimulatie. INMEST verschuift het evenwicht tussen sympathische en parasympathische tonus resulterend in een reductie van hartslag-variabiliteit.

De primaire uitkomst-meting in deze studie was vermoeidheid gedefinieerd door de vermoeidheid-ernst schaal (FSS) maar er werd geen significant effekt van INMEST-behandeling gezien met de betrekking tot deze uitkomst-variabele. We evalueerden ook de scores voor globale symptomen d.m.v. een vragenlijst waarvan eerder is gebleken dat ze subgroepen M.E.-patiënten kan onderscheiden. Tijdens de eerste maand behandeling, gaf placebo een bescheiden respons van ~10% reductie in symptoom-score, terwijl de aktief behandelde patiënten initieel verbeterde, waarna een ‘rebound’-effekt, gevolgd door een meer significante verbetering en een ~20% globale reductie van de symptoom-scores optrad na de eerste vier weken (8 aktieve behandelingen). Het is belangrijk om op te merken dat veel patiënten moeite hadden met de tweewekelijkse bezoeken aan de kliniek en dat sommige patiënten episodes van verslechtering ondervonden ten gevolge post-exertionele malaise. Tijdens de tweede fase van aktieve INMEST-behandeling (voor alle patiënten), volgde een verdere daling van de symptoom-scores en bij patiënten die aktieve behandeling kregen, werd slechts ~30% afname qua symptoom-scores bereikt aan het einde van de 8 weken (16 aktieve behandeling. […] Het effekt was significant sterker (p = 0.00003) bij de patiënten die enkel aktieve behandeling kregen t.o.v. patiënten die placebo gevolgd door aktieve behandeling kregen, en de respons hield aan na stopzetten van behandeling in beide groepen en verbeterde zelfs verder in de meest aktief behandelde groep, wat suggereert dat verdere verbeteringen mogelijk zijn met een langer behandel-protocol.

Immuunsysteem metingen correleren met symptoom-verlichting

Om de onderliggende immuunsysteem-verstoring bij M.E. te begrijpen en potentiële veranderingen correlerend met behandel-respons te onderzoeken, namen we bloedstalen af bij ‘baseline’ vóór behandeling, na fase 1 (4 weken) en na fase 2 (8 weken). Om technische variatie te minimaliseren, werden de stalen onmiddellijk na afname verwerkt en de cellen ingevroren in een stabilisatie-oplossing, plasma werd gecentrifugeerd en ingevroren, en totaal-bloed mRNA gestabiliseerd en ingevroren. We voerden analyses uit van de immuuncel-samenstelling en -fenotype d.m.v. massa-cytometrie, plasma proteïne-analyse […] en totaal-bloed mRNA-sequentiebepaling om verschillende perspectieven op de globale immuun-toestand bij ME-patiënten te verkrijgen vóór, tijdens en na behandeling. Het meest significant geïnduceerd gen door aktieve INMEST-behandeling was het E2 ubiquitine-conjugerend enzyme UBE2H, een gen dat breed tot expressie komt in immuuncellen uit het bloed […] en ubiquitine-gemedieerde afbraak van dysfunktionele proteïnen stimuleert.

Plasma-cytokinen IL-17A, IL-12B & CCL28 bleken de top plasma-proteïnen die daalden na INMEST-behandeling en deze bleken eerder al betrokken bij M.E. Circulerende immuuncellen veranderden ook, bijzonderlijk de pro-inflammatoire monocyten daalden met verloop van tijd tijdens INMEST-behandeling.

Daarna wenden we ‘mixed-effects’ model [statistisch model voor herhaalde metingen dat zowel vaste als willekeurige effekten bevat] aan om te testen of individuele immuunsysteem-metingen geassocieerd waren met symptoom-verlichting (gemeten via symptoom-score vragenlijsten). We gebruikten ook leeftijd, geslacht, behandel-groep (pre-/post-INMEST) en aantal behandelingen als vaste effekten, en vonden dat de frequenties van pro-inflammatoire monocyten in het bloed, plasma IL-12B & CCL28, en andere pro-inflammatoire mediatoren verminderden naarmate symptoom-scores daalden na INMEST-behandeling. Deze resultaten onderlijnen verder de inflammatoire aard van M.E., waarbij variabele niveaus van cytokine-verhoging in plasma correleren met symptoom-ernst. Onze resultaten tonen ook dat de biomerker-correlaten van respons bij ME-patiënten gemeten kunnen worden in het bloed.

Multi-omica factor-analyse onthult co-regulatie van biomerkers bij M.E.

Immuuncellen en proteïnen funktioneren niet op een geïsoleerde manier maar hun aktie is gecoördineerd in een complex netwerk van communicerende kenmerken. Multi-Omica Factor Analyse (MOFA) is een methode waarbij verschillende types gegevens worden geïntegreerd [zie Materialen & methodes], en zo toelaat deze kenmerken te identificeren en associëren met een aandoening, in de vorm van latente variabelen die groepen onderscheiden. MOFA werd bij onze groep toegepast op alle plasma-proteïnen, immuuncel-frequenties en mRNA-metingen voor alle bloedstalen (n = 85). Er werd een waaier aan variabele MOFA-modellen bekeken tot een model met 10 latente factoren (LFs) werd gevonden die de variantie in de stalen verklaart. We inspecteerden de stalen voor deze LFs om factoren te identificeren die stalen afgenomen vóór en na INMEST-behandeling konden opsplitsen. LF7 toonde een dergelijk verloop van pre- naar post-INMEST en we focusten op deze latente factor. Bij LF7 was er een overlap van 65% van de genen en 50% van de plasma-proteïnen met het significant kenmerk in bovenstaand ‘mixed-effect’ model, wat benadrukt dat kenmerken geassocieerd met INMEST-respons kunnen worden gemeten in het bloed, maar het MOFA-resultaat verbreedt ook het terrein van de immunologische kenmerken die worden beïnvloed door INMEST en suggereert ook een verschuiving van CD56dim naar een meer CD56bright type NK-cellen, waarvan is geweten dat het immunoregulerende cytokine-sekreterende cellen zijn.

Cel-cel verbanden zijn verstoord bij M.E.

Gezien de gecoördineerde wijzigingen geïnduceerd door INMEST-behandeling voor verschillende immuunsysteem-componenten, besloten we de cel-cel afhankelijkheden nader te bekijken en hoe deze geherstruktureerd zouden zijn door de behandeling. Dit is belangrijk omdat alle immuun-responsen optreden als geconcerteerde inspanningen door meerdere cel-populaties, en verstoringen van dergelijke verbanden kunnen een element van de ziekte zijn. Daartoe vergeleken we cel-cel correlatie-matrixen vóór en na INMEST-behandeling en we vonden specifieke cel-cel verbanden die veranderd waren na INMEST-behandeling. Bv.: er werden positieve associaties gevonden tussen naïeve en ‘central memory’ T-cellen, die meer uitgesproken werden na INMEST, waarschijnlijk een weerspiegeling van verbeterde cel-cel coördinatie binnen het systeem ten gevolge de hierboven beschreven gedempte inflammatie.

Bovendien waren ‘mucosal-associated invariant’ T-cellen (MAIT-cellen) [zie ‘Verstoring van effector & regulerende T-cel subsets bij M.E.(cvs)’ & ‘Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)’] en ‘marginal zone’ (IgD+ ‘memory’) B-cellen, beide belangrijke cellen die interageren met microben in de darm, betrokken. […]. Bij deze cel-cel correlatie-analyses, waren deze effector-cellen omgekeerd gecorreleerd met aan antigen blootgestelde (‘memory’) regulerende T-cellen, een type cel die gekend is voor z’n cruciaal belang bij het behouden van homeostase aan barrière-oppervlakten zoals de darm. Dit verband was niet te zien bij ‘baseline’ maar dook op na INMEST-behandeling, wat wijst op een normalisatie van een kritieke immuuncel-module en regulerend mechanisme parallel met symptoom-verlichting. We denken dat deze bevinding een bijkomende aanwijzing voor M.E.-pathogenese en het werking-mechanisme van INMEST vertegenwoordigt, aangezien dysbiose waarschijnlijk is bij M.E. [zie Proal A & Marshall T. hierboven], en de nervus vagus brengt dergelijke afferente signalen over van de darm naar de hersenstam en induceert immuun-regulering via de inflammatoire reflex. De reductie qua plasma-waarden van IL-17A en CCL28 na INMEST en de herstelde MAIT/regulerende T-cel relatie duidt op een modulering van deze as door INMEST-behandeling en verzachting van een inflammatoire toestand die z’n oorsprong heeft aan de immune-microbe interface in de darm. Ook werd gerapporteerd dat het Epstein-Barr virus, EBV, dikwijls verbonden met M.E., IL-17 induceert en reaktivatie van dit virus is een andere mogelijke chronische immuun-stimulatie bij M.E.-patiënten.

Transcriptionele programma’s gewijzigd bij M.E.-patiënten behandeld met INMEST

Om de mogelijke werking-mechanismen van INMEST bij deze M.E.-patiënten verder te exploreren, onderzochten we meer diepgaand het totaal-bloed transcriptoom. INMEST-behandeling upreguleerde 142 genen (p < 0.05) en downreguleerde 12.384 genen (p < 0.05). Er werd een gen-set aanrijking analyse uitgevoerd op deze differentieel gereguleerde genen om de aangetaste molekulaire mechanismen te begrijpen. De meest aangerijkte Gen Ontologieën (GO [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten]) hebben betrekking op drie brede biologische processen; I) zenuwcel signaal-transmissie, II) immuunrespons-mechanismen en III) cellulair metabolisme, die eerder allemaal gelinkt werden aan de pathogenese van M.E.

Een set genen betrokken bij ‘long-term synaptic potentiation’ [de langdurige versterking van de communicatie tussen twee neuronen, verhoging van doeltreffendheid van een synaps] was verhoogd bij INMEST-behandeling, bijzonderlijk na > 8 behandel-sessies. Voorbeelden omvatten SYNC, een gen coderend voor het proteïne alfa-synucleïne aanwezig in neuronale pre-synaptische uiteinden dat neuronale signaal-transmissie reguleert. De T-cel co-stimulatie genen-set omvat molekulen zoals CD86 [proteïne dat co-stimulerende signalen geeft die nodig zijn voor T-cel aktivatie] op antigen-presenterende cellen, die noodzakelijk zijn voor co-stimulerende T-cellen geaktiveerd door antigenen. De meeste van deze genen waren gedaald na INMEST, wat overéénkomt met een globale demping van immuuncel-aktivatie bij M.E.-patiënten behandeld met INMEST.

In een studie door Davis R et al. werd gerapporteerd dat bloedcellen van M.E.-patiënten een uniek impedantie-patroon vertonen in respons op hyperosmotische stress, wat suggereert dat een nano-electronische impedantie-sensor zou kunnen gebruikt worden als een diagnostische test voor M.E. [A nanoelectronics-blood-based diagnostic biomarker for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). (2019) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116; resultaten wachten nog op replicatie]. We vinden dat de GO respons-op-osmotische-stress geassocieerd was met INMEST-behandeling, en de betrokken genen omvatten BAX [bevordert apoptose] (lid van de Bcl2-familie [apoptotische regulatoren]).

Ten slotte bleken meerdere genen-sets die worden gereguleerd door INMEST betrokken bij het cellulair energie-metabolisme, wat merkwaardig is gezien het feit dat vermoeidheid het kardinaal symptoom van M.E. is en gelinkt met veranderingen in het cellulair metabolisme [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639; zie ook ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’ enz.]. De GO negatieve-regulering-van-cellulair-koolhydraten-metabolisme wordt beïnvloed door INMEST via genen zoals GCK, coderend voor de glucose-sensor glucokinase, die het cellulair metabolisme doet verschuiven op basis van de beschikbaarheid van glucose en in deze groep onderdrukt bleek bij M.E.-patiënten na INMEST-behandeling.

Om veranderingen qua energie-metabolisme te onderzoeken bij M.E.-patiënten, gebruikten we de Agilent Seahorse analyse [zie Materialen & methodes] op PBMCs van M.E.-patiënten bij ‘baseline’, en na 8 en 16 behandel-sessies. Deze test meet meerdere aspecten van het cellulair metabolisme, en ATP-verbruik en oxidatieve fosforylatie. Zoals voorspeld door de hierboven aangehaalde resultaten van mRNA-sequentiebepaling, vonden we verbeteringen qua energie-metabolisme in PBMCs van M.E.-patiënten behandeld met INMEST, zowel voor maximale respiratie en reserve respiratoire capaciteit, suggererend dat INMEST een impact heeft op meerdere mechanismen waarvan eerder werd gerapporteerd dat ze verstoord zijn bij M.E.

M.E. – een falen van de inductie van ziekte-tolerantie bij chronische immuun-aktivatie

Gezien het bewijsmateriaal omtrent chronische immuun-aktivatie bij M.E. en de symptomen bij de ziekte, bekeken we mogelijke unificerende mechanismen die de variabele presentatie van deze mysterieuze ziekte kunnen verklaren. Ziekte-tolerantie is een algemene term ter beschrijving van een reeks stress-respons mechanismen ter beperking van weefsel-schade veroorzaakt door binnendringende pathogenen of indirect door immuun-responsen van de gastheer. Onze hypothese was dat M.E. te wijten kon zijn aan een falen van de upregulering van dergelijke ziekte-tolerantie mechanismen in respons op infektie. Daartoe analyseerden we genen betrokken bij de inductie van ziekte-tolerantie, op basis van een transcriptioneel regulerend netwerk database. De meeste effector-genen verhoogden hun mRNA-expressie na aktieve INMEST-behandeling bij ME-patiënten, wat de hypothese ondersteunt dat inductie van ziekte-tolerantie M.E.-symptomen kan verlichten. We focusten dan op ziekte-tolerantie mechanismen die het sterkst ge-upreguleerd waren door de behandeling. HIF-gereguleerde effector-genen [hypoxie-induceerbare factoren; transcriptie-factoren die reageren op dalingen van de beschikbare zuurstof in het cellulair milieu] zoals VEGFA, CXCR4, AR & SERPINE1 worden geïnduceerd door weefsel-hypoxie tijdens infekties, een respons die belangrijk is voor het beperken van weefsel-schade die wordt versterkt door INMEST. Davis RW et et al. rapporteerden hogere waarden qua reaktieve zuurstof-soorten (ROS) in rode bloedcellen van M.E.-patiënten t.o.v. gezonde controles [Red blood cell deformability is diminished in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clinical Hemorheology and Microcirculation (2019) 71: 113-116], en upregulering van het oxidatieve stress respons mechanisme door INMEST (SIRT1 [betrokken bij mitochondriale biogenese]) bekrachtigen deze observatie. Deze ge-upreguleerde mechanismen en de inductie van genen van het insuline-receptor signalisering mechanisme, ‘heat-shock’ proteïnen en cel-cyclus regulators ondersteunen allemaal het idee dat INMEST-behandeling ziekte-tolerantie mechanismen upreguleert die normaal geïnduceerd zijn tijdens infekties, en mogelijks ongepast onderdrukt zijn bij M.E.-patiënten.

Tot besluit: onze bevindingen tonen bewijs voor chronische immuun-aktivatie bij patiënten met M.E., waarbij bijzonderlijk het IL-17 mechanisme, MAIT-cellen en andere intestinale lymofcyten (die interageren met microben) betrokken zijn. De INMEST-behandeling die een invloed uitoefent via de nervus vagus, induceert een significante verlichting van symptomen die correleert met een normalisatie van immuuncel-regulerende netwerken, cellulair metabolisme en upregulering van ziekte-tolerantie.

Bespreking

Onze bevindingen schetsen een beeld van M.E. als een waarachtige veelzijdige aandoening waarbij inflammatie is betrokken met een mogelijke oorsprong ter hoogte van de immuun/microbe-interface in de darm. Chronische immuun-stimulatie is waarschijnlijk, gezien de symptomatologie maar er worden ook gestegen cytokine-waarden gevonden die correleren met symptoom-ernst en immuuncel-deficiënties. De deficiënties qua cellulair metabolisme worden niet typisch gezien bij andere inflammatoire ziekten, hoewel voorbijgaande metabole aanpassingen courant zijn tijdens immuun-responsen.

Het is belangrijk om op te merken dat M.E. een heterogene ziekte is en de kans op het vinden van één pathogeen mechanisme bij alle patiënten is laag. We geloven dat één unificerend concept mogelijks het falen van de upregulering van ziekte-tolerantie mechanismen is in geval van een infektie of virus-reaktivatie, en dit is wat we hier voorstellen. Dergelijke ziekte-tolerantie mechanismen zijn belangrijk voor het inperken van de reductie van de fitheid van de gastheer ten gevolge de infektie zelf of ten gevolge de opgewekte immune verdediging. Onze gegevens betreffende ge-upreguleerde ziekte-tolerantie mechanismen door INMEST-behandeling ondersteunen de hypothese dat M.E. het resultaat is van een falen om ziekte-tolerantie mechanismen te upreguleren bij confrontatie met infektie, wat dan leidt tot een verslechtering van fysiologische funkties, hoewel de precieze mechanismen van hiervan nog dient te worden ontrafeld. De redenen waarom M.E.-patiënten zoveel verschillen wat betreft symptomatologie, zou verklaard kunnen worden door verschillen in de onderliggende infektueuze ziekte of immuun-aktivatie, en het relevant ziekte-tolerantie mechanisme dat niet wordt geïnduceerd. De redenen waarom M.E.-patiënten falen wat betreft de upregulering van ziekte-tolerantie mechanismen dient nog te worden bepaald, hoewel een interessante aanwijzing komt van een observatie omtrent mutaties in het enzyme IDO2 bij 20/20 patiënten met ernstige M.E., die leidde tot de formulering van de ‘IDO [indolamine-2,3-dioxygenase] metabolic trap’ hypothese voor M.E. [Kashi AA, Davis RW, Phair RD. The IDO Metabolic Trap Hypothesis for the etiology of ME/CFS. Diagnostics (2019) 9: 82; hypothese aangaande het kynurenine-mechanisme: “de overgang van de normale fysiologische evenwicht-toestand naar het alternatief evenwicht dat kan worden geïnitieerd door elke trigger die de tryptofaan-concentratie in het cytosol boven een kritiek punt kan verhogen; dit alternatief, of pathologisch, evenwicht wordt gekenmerkt door een onvoldoende aanmaak van kynurenine uit tryptofaan, met daaropvolgende stoornissen in het centraal zenuwstelsel, gastro-intestinaal, en qua immuunfunktie en energie-metabolisme” – zie ook ‘Kynurenine mechanisme hypothese’]. De IDO-enzymen zijn echter ook betrokken bij ziekte-tolerantie, specifiek na blootstelling aan endotoxine, een component van Gram-negatieve bakterieën in de darm.

De symptoom-verlichting die wordt geïnduceerd door INMEST gericht op de nervus vagus is significant en verschillend van placebo, en de biomolekulaire correlaten die meerdere gesuggereerde aspecten van M.E.-pathogenese bekrachtigen werden vastgesteld. Het werkingsmechanisme van de INMEST-behandeling bij M.E. en verderop is onduidelijk, hoewel sommige zaken wel duidelijk zijn. We weten dat de nervus vagus kernen in de hersenstam geaktiveerd worden via INMEST, maar ook hogere centra zoals het limbisch systeem worden geaktiveerd. Het effekt van INMEST op hartslag-variabiliteit verschilt van dat van traditionele nervus vagus stimulatie-methodes. Eén mogelijkheid is dat INMEST binnenkomende (afferente) signalen van de darm beïnvloedt, waardoor signalen van dysbiose of chronische immuun-aktivatie en inflammatie worden overgebracht. Deze hypothese komt overéén met eerdere voorstellen aangaande M.E. als een ziekte die wordt veroorzaakt door microbiële dysbiose in de darmen [Staines D et al. A systematic review of enteric dysbiosis in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Syst Rev (2018) 7: 241]. Eén mogelijk mechanisme voor de symptoom-verlichting na INMEST-behandeling zou kunnen zijn via het beperken van dergelijke signalen van darm-dysbiose via de afferente nervus vagus.

Een probleem met de hier gepresenteerde behandeling-proef is dat M.E.-patiënten gedwongen waren de kliniek om de twee keer per week gedurende 8 weken te bezoeken (voor de behandeling en bloedafname), alsook te antwoorden op vragenlijsten. Al deze aktiviteiten waren zeer belastend en veroorzaakten verslechtering bij sommige patiënten, wat enkele van de mogelijke voordelen van de behandeling verdoezelen. We vonden geen significante verbetering van de primaire uitkomst-meting, vermoeidheid in deze studie. Een mogelijke verklaring daarvoor is de terugkerende bezoeken aan de kliniek en de daaropvolgende verslechtering van de ziekte. Een andere mogelijke verklaring houdt verband met de ‘Fatigue Severity Scale’, FSS, omdat – hoewel deze vragenlijst heeft getoond de patiënten met M.E. het best worden onderscheiden van gezonde individuen – z’n vermogen om kwantitatieve veranderingen bij dezelfde patient met verloop van tijd te omvatten in vraag wordt gesteld, en plafond-effekten werden gerapporteerd. In de toekomst zal een meer duurzame manier om INMEST aan te wenden het gebruiken van een zelf-behandeling toestel (door individuen en zorgverleners, thuis) zijn. Het is vanzelfsprekend dat grotere ‘follow-up’ studies vereist zijn om verder de klinische waarde van deze benadering meer algemeen te bepalen bij M.E.-patiënten. Het is belangrijk de diagnostische accuraatheid van M.E. te verbeteren en meer homogene groepen patiënten op te nemen om het vermogen aan te scherpen om de onderliggende pathologie van M.E. te begrijpen (opdelen in patiënten-groepen en behandel-strategieën in deze subgroepen testen). De vooruitgang qua diagnostische testen is in dit opzicht beloftevol. We hopen dat dit werk anderen zal inspireren om de immune/microbe-interface en het falen om ziekte-tolerantie te induceren bij M.E. verder te onderzoeken en hopelijk zal deze verhoogde aandacht leiden tot verdere verlichting bij de miljoenen die lijden onder deze destruktieve aandoening.

Materialen & methodes

Studie-ontwerp

[…]

Experimenteel ontwerp

INMEST twee maal per week gedurende 8 weken. De eerst 4 weken (willekeurige selektie) placebo of aktieve gevolgd door 4 weken enkel aktieve behandeling. Tijdens de eerste 4 weken waren de patient en de arts in het ongewisse over het feit of placebo of aktieve behandeling werd gegeven. Uiteindelijk omvatte de aktieve/aktieve groep 5 mannen en 11 vrouwen, de placebo/aktieve groep 3 mannen en 12 vrouwen.

Eén van de belangrijkste factoren die werd geregistreerd tijdens deze studie is de M.E. symptoom-beoordeling schaal: de ernst van symptomen van de ICC-criteria wordet gescoord op een schaal van 5 punten van 0-4 (geen, licht, matig, ernstig, zeer ernstig) om de ziekte-last te beoordelen […]. Daarnaast: ‘Fatigue Severity Scale’, SF-36 ‘Physical Functioning’ subschaal (PF-10), ‘Hospital Anxiety Depression’ schaal, EQ5D [vragenlijst die peilt naar mobiliteit, zelfzorg, dagelijkse aktiviteiten, pijn/ongemak en angst/depressie] en VAS [visuele analoge schaal]. Er werden op 3 tijdspunten bloedstalen were afgenomen (baseline plus pre-/post-behandeling na placebo of aktieve behandeling na 8 of 16 weken).

Immuuncel-fenotypering via massa-cytometrie

[…]

Antilichamen en reagentia

[…]

ProSeek verzameling van gegevens

Gegevens over plasma-proteïnen werden gegenereerd met de ‘proximity extension assay’ [PEA; immuno-assay voor de detektie van proteïnen, ontwikkeld door co-auteurs van Olink AB, Uppsala], m.n. via de panels Inflammatie, Metabolisme en Neuro-Explorerend). […]

Totaal-blood mRNA-sequentiebepaling

[…]

OCR (‘oxygen-consumption-rate’) -meting

De Seahorse XFe96 Analyzer [voor meer uitleg zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’] (Seahorse Bioscience) werd gebruikt om de zuurstof-consumptie in PBMCs van M.E.-patiënten te meten. […]

Cel-klassificatie

[…] We bekeken de volgende populaties [witte bloedcellen]: B-cellen (IgD+ ‘memory’ B-cellen, IgD- ‘memory’ B-cellen, naïeve B-cellen, transitionele B-cellen en plasmablasten), CD4 T-cellen (‘central memory’ CD4T, ‘effector memory’ CD4T, naïeve CD4T, naïeve Tregs en ‘memory’ Tregs), CD8 T-cellen (geaktiveerde CD8T, ‘central memory’ CD8T, DP [dubbel-positieve CD4+CD8+] T-cellen, ‘effector memory’ CD8T en naïeve CD8T), eosinofielen, MAIT, monocyten (klassieke, niet-klassieke en pro-inflammatoire), ‘natural killer’ (NK) cellen (CD56bright NK & CD56dim NK), neutrofielen, basofielen, γδT [gamma delta T-cellen] (CD161+ & CD161-) en pDCs [plasmacytoïde dendritische cellen]. […]

‘Mixed-effects’ modelering

[…] Dit liet toe de variabelen te nestelen, individuen te linken in sets van vóór en na INMEST-behandeling maar ook rekenschap te geven voor geslacht, leeftijd alsook symptoom-scores en aktieve behandelingen.

Multi-omica factor analyse (MOFA)

[MOFA is een statistisch kader voor uitgebreide integratie van multi-modale gegevens van enkelvoudige cellen.] De input in MOFA is een set matrixen met plasma-proteïne expressie, cel-hoeveelheden en gen-expressie. […]

Genen-set aanrijking analyse (GSEA)

[…] Onderzoeken van aangerijkte genen-sets overéénkomstig het aantal aktieve behandelingen. […] [GSEA is een computer-methode die bepaalt of een a priori gedefinieerde set genen statistisch significant is, overéénkomstig verschillen tussen twee biologische toestand (bv. fenotypes).]

Ziekte-tolerantie netwerken

[…]