Dat er bij M.E.(cvs) veranderingen qua cytokinen optreden, staat buiten kijf. Er bestaan echter nogal wat tegenstrijdigheden over welke dat zijn. Het wordt stilaan duidelijk dat één enkele niet als merker kan worden gehanteerd maar dat een combinatie wellicht bepaalde subgroepen zal kunnen aangeven.
Onderzoeken leverden zeer tegenstrijdige resultaten op, hoofdzakelijk omwille van verschillen qua gebruikte definitie, studie-populatie en labotatorium-protocollen (meet-techniek, soort staal) maar ook omdat dikwijls geen rekening wordt gehouden met hoe de cytokinen op elkaar inspelen, de ‘immune context’…
Een team rond Prof. Nancy Klimas rapporteerde eerder (zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS’): “IL-17 en IL-23 waren niet significant verschillend bij CVS-gevallen vergeleken met controles. De ongewijzigde IL-17 en IL-23 waarden bij CVS opgetekend in deze studie zou een argument zijn tégen bakteriële gastro-intestinale infekties en tégen een belangrijke rol bij persisterende ziekte.”. Dit was bij een “brede” populatie van met een verschillende ziekte-trigger.
In het artikel hieronder (o.a. ook met Klimas) werd nu gevonden dat IL-23, een cytokine dat tot expressie wordt gebracht door dendritische cellen en macrofagen, het meest opvallende verschil was. Hoewel dit cytokine niet vereist is voor de ontwikkeling van Th17-cellen is het toch essentieel voor de volledige en continue differentiatie van de Th17-cel subgroep.
Zo ziet men dat wetenschappelijk onderzoek steeds verder dient te worden bijgeschaafd. En juist omdat het hier een kleine groep specifiek omlijnde groep patiënten betreft, mag men dus niet veralgemenen en dienen de resultaten te worden gerepliceerd… Het belang van subgroepering bij M.E.(cvs) wordt hierbij dus ook nogmaals benadrukt!
————————-
J Transl Med. (2012) 10(1): 191
Cytokine expression profiles of immune imbalance in post-mononucleosis chronic fatigue
Broderick G, Katz BZ, Fernandes H, Fletcher MA, Klimas NG, Smith FA, O’Gorman MR, Vernon SD, Taylor R
1 Division of Pulmonary Medicine, Department of Medicine, University of Alberta, WMC 2E4.41 WC Mackenzie Health Sciences Centre, 8440 112 Street, Edmonton, AB T6G 2R7, Canada
2 Division of Infectious Diseases, Children’s Memorial Hospital, Chicago, IL, USA
3 Department of Medicine, University of Miami, Miami, FL, USA
4 Miami Veterans Affairs Medical Center, Miami, FL, USA
5 Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern, Chicago, IL, USA
6 CFIDS Association of America, Charlotte, NC, USA
7 Department of Occupational Therapy, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, USA
Samenvatting
Achtergrond: Aangezien bekend is dat Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kan volgen op Epstein-Bar virus (EBV) en andere systemische infekties, was het onze doelstelling verschillen te beschrijven betreffende immuun-aktivatie bij post-infektueuze CVS (PI-CVS) patiënten en herstelde controles. We bestudeerden 301 adolescenten prospektief [gedurende een tijd volgen, om te bepalen hoe factoren een bepaalde uitkomst opleveren] gedurende 24 maanden na de diagnose van of monospot-positieve infektueuze mononucleose (IM). [De ‘monospot’ test is een snelle test die anitlichamen aangemaakt in respons op EBV-infektie aantoont.] We vonden op 6, 12 en 24 maanden een incidentie van CVS van 13%, 7% en 4% respectievelijk.
Methodes: Gebruikmakend van chemiluminescente beeldvorming [chemoluminescentie is het uitzenden van licht t.g.v. een chemische reaktie] hebben we de plasma-concentraties van IL-1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12 (p70), 13, 15, 17 & 23, IFN-gamma, TNF-alfa en TNF-beta in duplo gemeten, van in een bio-bank beschikbare stalen van 9 PI-CVS individuen en 12 herstelde controles, 24 maanden na infektie.
Resultaten: Een standaard vergelijkende analyse gaf significante verschillen qua IL-8 en IL-23 aan tussen de groepen. Na constructie van een klassificatie-model werden IL-6, IL-8 en IL-23 via 2 verschillende statistische benaderingen geselekteerd als onderscheidende kenmerken (IL-1a, IL-2 en IFN-gamma waren ook geselekteerd in het één of het ander model). Dit gaf een accuraat onderscheid (beter dan 80% bij betrouwbaarheid-niveau 0.95) tussen PI-CVS en herstelde controles.
Besluit: Deze resultaten suggereren dat co-expressie patronen van niet minder dan 5 cytokinen, die geassocieerd zijn met Th17 funktie, beloftevol zouden kunnen zijn als diagnose-instrument voor post-infektueuze CVS.
Achtergrond
[…]
Er is een overweldigende hoeveelheid bewijsmateriaal dat de link met een infektueuze etiologe bij ten minste een subgroep CVS-patiënten versterkt, ondanks het feit dat specifieke virale serologie [aanwezigheid van antilichamen] niet vereist is voor de diagnose van CVS. Er is een opvallende en lang-bekende associatie tussen CVS en EBV-infektie. In eerdere, door ons gepubliceerde analyses over adolescenten, rapporteerden we een diagnose van CVS op 6, 12 & 24 maand na IM bij 13%, 7% & 4% van de individuen, respectievelijk. […].
Onderzoekers probeerden de onderliggende oorzaken van de persistente symptomen te begrijpen d.m.v. het inspekteren van de immuun-signalisering in de CVS-populatie. De eerste metingen van cytokine-concentraties in bloedstalen uit een brede populatie leverde zeer tegenstrijdige resultaten op, hoofdzakelijk omwille van verschillen qua definitie en labo-protocollen. Beperkende factoren omvatten ook de focus op een afwisselende en enge selektie cytokinen [Fletcher MA, Zeng XR, Barnes Z, Levis S, Klimas NG: Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med (2009) 7: 96 - zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS’], alsook een conventionele univariate analyse [meest eenvoudige statistische analyse met slechts één variabele] die geen rekenschap hield met de context-specifieke expressie van cytokinen [Broderick G, Fuite J, Kreitz A, Vernon SD, Klimas N, Fletcher MA: A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun (2010), 24: 1209-1217 - zie ‘Cytokine-netwerken bij CVS’]. Slechts één eerdere studie heeft prospektief cytokinen-produktie geëvalueerd bij CVS-patiënten met een uniforme infektueuze trigger ondersteund door serologie. Hickie et al. [Post-infective and Chronic Fatigue Syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens: prospective cohort study. B.M.J (2006) 333: 575] maten de concentraties van 8 cytokinen (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α en IFN-γ) in serum en cultuur-supernatants [vloeistof die boven de cellen staat na centrifugatie van cultuurmedium] van PMBCs […] na een acute ziekte (IM, Ross River koorts [RRVirus; epidemische polyarthritis] of Q-koorts). De deelnemers waren 22 individuen met bevestigde PI-CVS […] en 42 controle-individuen […], gematcht voor leeftijd en uit dezelfde groep maar die waren hersteld binnen de 6 weken na de aanvang van de symptomen. De analyses werden uitgevoerd bij alle PI-CVS individuen als één groep, waarbij de 11 EBV-patiënten werden gecombineerd met deze geïnfekteerd met een virus dat niet courant voorkomt in Australië. Er werden geen significante verschillen gevonden tussen PI-CVS en herstelde controles […] [Vollmer-Conna U, Cameron B, Hadzi-Pavlovic D, Singletary K, Davenport T, Vernon SD, Reeves WC, Hickie I, Wakefield D, Lloyd AR, Dubbo Infective Outcomes Study Group: Post-infective fatigue syndrome is not associated with altered cytokine production. Clin Infect Dis (2007) 45: 732-735]. De cytokine-waarden in het serum lagen echter bijna uitsluitend onder de detektie-limiet van de test (8-15 pg/ml) […]. Zo bleven er meerdere onbeantwoorde vragen. Bijvoorbeeld: zijn er belangrijke CVS-specifieke cytokinen die we niet kunnen meten? En misschien belangrijkst van allemaal: zouden PI-CVS cytokine-signaturen de pathogen-specifieke (en geslacht-specifieke) variaties in immuun-respons kunnen weerspiegelen? Indien dit zo is, zouden ze verloren kunnen gaan bij het poolen van individuen met verschillende infektueuze triggers (en verschillend geslacht).
In een poging om enkele van deze vragen te beantwoorden, focuste deze secundaire analyse zich specifiek op een groep vrouwelijke adolescenten met de diagnose van PI-CVS (als gevolg van een uniform en gekend pathogen, namelijk EBV. Een uitgebreid onderzoek van 16 cytokinen werd uitgevoerd in het plasma d.m.v. een gemodificeerde chemiluminescentie-test en identificeerde significante verschillen qua IL-8 en IL-23 concentratie in de patiënten-groep op 24 maanden na infektie. Omdat cytokinen tot expressie komen op een gecoördineerde manier; breiden we de analyse ook uit tot buiten de traditionele univariate analyse om de gecombineerde effekten te onderzoeken van meerdere cytokinen. Alles tesamen ondersteunde de klassificatie van individuen op basis van de concentraties aan IL-2, IK-6, IL-8 & IL-23 de toewijzing tot patiënten- of controle-groep met een accuraatheid van meer dan 80% (toegepast in relatie tot interferon-gamma). Interessant is dat deze laatste niet significant verschilde qua expressie-niveau bij de groepen.
Bespreking
In dit werk bestudeerden we een populatie van adolescenten die CVS ontwikkelden volgend op monospot-positieve IM en we vergeleken hen met controle-individuen die op normale wijze herstelden van dezelfde infektie. Ongeveer 4% van de individuen met een IM-diagnose (n = 13) voldeden aan de definitie voor CVS op 24 maand, een aantal dat consistent is met andere prospektieve studies naar CVS met een infektueuze start. Na vergelijking (gevallen versus herstelde controles) van de concentraties van 16 cytokinen, vonden we significant verschillende waarden qua IL-8, IL-23 en mogelijks IL-2 & IL-5 in plasma-stalen van CVS-patiënten. Verhoogd IL-8 en gedaald IL-5 is een patroon dat ook wordt gezien bij asthma en bij B-cel chronische lymfocyten leukemie (B-CLL). Opvallendst waren verschillen qua IL-23, een cytokine dat tot expressie wordt gebracht door dendritische cellen en macrofagen. Hoewel niet vereist voor de ontwikkeling van Th17-cellen uit naïeve CD4+ T-cellen, is IL-23 niettemin essentieel voor de volledige en continue differentiatie van de Th17-cel subgroep. De mediane concentratie van dit cytokine was significant lager bij CVS-patiënten dan bij herstelde controles. IL-23 expressie is zeer induceerbaar in PHA-gestimuleerde CD4+ cellen [PHA, fytohaemagglutinine, een mitogeen, induceert cel-deling], in het bijzonder wanneer deze ge-‘prime’-d zijn met IFN-γ, wat een potentiële rol voor IL-23 bij de Th1-respons suggereert. We vonden verminderde expressie van IL-23 bij CVS-patiënten ondanks vergelijkbare IFN-γ waarden. Daarnaast vonden we dat de waarden van IL-17 gelijkaardig waren ondanks gestegen waarden van de gekende antagonist IL-2. Consistent hiermee is dat onze vroegere analyse van cytokine-expressie bij een populatie van volwassen individuen met CVS van ongekende etiologie wees op een abnormaal gedempte IL-23/Th17/IL-17 respons op gestegen waarden van de gekende inductoren IL-1b en IL-6.
De hierboven vermeldde tegenstrijdigheden benadrukken het belang van de immune context. Het was inderdaad noodzakelijk de gecombineerde expressie van 5 cytokinen te gebruiken om een robuste scheiding tussen patiënten en herstelde controles te verkrijgen. De context die de expressie van deze cytokinen linkt, komt ten slotte voort uit één of meerdere basis immuun-processen die samenwerken. De keuze van cytokinen hier […] is interessant omdat ze direct of indirect gerelateerd zijn met de Th17-respons. Bij deze analyse werden IL-6, IL-8 en IL-23 geselekteerd via twee verschillende statistische benaderingen, waar IL-1a, IL-2 en IFN-γ ook werden geselekteerd in het ene of het andere model. Het is interessant dat noch IL-1a, noch IL-6 of IFN-γ differentieel tot expresie kwamen bij de groepen, zelfs als ze significant bijdroegen tot de klassificatie van deze individuen. IL-1, IL-6 en IL-23 zijn gekende inductoren voor Th17-respons, wat op z’n beurt een producent is van IFN-γ. Anderzijds staat IL-2 algemeen bekend als een Th17-antagonist. Er werd een mechanisme beschreven waarmee IL-1 de produktie van IL-23 induceert via NF-kappa B aktivatie, wat op z’n beurt de aanmaak van IL-6 & IL-8 bevordert in menselijke fibroblast-achtige synoviocyten [cellen van het slijmvlies dat de gewrichtsholte -synovium- omhult] van patiënten met Reumatoïde Arthritis. Hoewel dit nog niet goed wordt begrepen, ondersteunt bewijsmateriaal uit dieren-modellen een rol voor EBV en EBV-induceerbare genen in de pathogene modulatie van de Th17-respons. Daar kan TLR9, waarvan werd aangetoond dat het een significante rol speelt bij de herkenning van EBV door primaire dendritische cellen [DCs; een type witte bloedcellen, antigen-presenterende cellen die immuun-responsen initiëren en reguleren] bij betrokken zijn, zoals aangewezen door een uitgesproken inhiberend effekt op hun synthese van IFN-α, IL-6 en IL-8. Tesamen suggereren de huidige analyse, alsook resultaten van eerder werk, dat ziekte-specifieke verschillen qua regulering van de Th17-respons een gedeelde component kunnen zijn bij een significante subgroep met CVS.
Bij vergelijking van dit werk met resultaten van andere studies is het belangrijk het type staal en de bestudeerde specifieke patiënten-populatie in acht te nemen. Werk door Brenu et al. [Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 - zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’] bv., toonde hogere waarden van IL-10, IFN-γ en TNF-α aan bij CVS. Dit werd echter gemeten in mitogen-gestimuleerde CD4+ cel-culturen, niet in plasma. Gelijkaardige in vitro protocollen werden aangewend in vroeger werk door Amel Kashipaz et al. [Normal production of inflammatory cytokines in Chronic Fatigue and fibromyalgia Syndromes determined by intracellular cytokine staining in short-term cultured blood mononuclear cells. Clin Exp Immunol (2003), 132: 360-365] & Skowera et al. [High levels of type 2 cytokine-producing cells in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Exp Immunol (2004) 135: 294-302]. Gebruikmakend van hetzelfde type staal en laboratorium-protocol dat hier werd toegpast, rapporteerden we eerder hogere waarden aan IL-5 en lagere waarden aan IL-8 bij CVS-individuen vergeleken met gezonde controles, terwijl de IL-23 niveaus weinig verschil vertoonden. Zowel het werk van Broderick et al. (2010) & Brenu et al. (2011) [ref. zie hierboven] werden echter in een veel bredere populatie CVS-patiënten, waar de ziekte-trigger niet uniform was, uitgevoerd. Daarenboven bestond de controle-populatie uit gewone gezonde controles en niet uit individuen die herstelden van acute infektie. Schattingen van het aantal CVS-patiënten die hun ziekte kunnen vastpinnen op een specifieke (verondersteld infektueuze) acute ziekte lag tussen 20 & 90%, waarbij de hoogste percentages bij adolescenten lagen. Zodoende liggen onze huidige resultaten dicht bij die van een andere studie die specifiek bij een post-infektueuze patiënten-populatie werd uitgevoerd door Vollmer-Conna et al. (2007) [ref. zie hierboven]. Die auteurs vonden geen verschillen qua serum-concentrations van IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α & IFN-γ. Met de mogelijke uitzondering van gestegen IL-2, vonden we ook geen verschillen bij deze cytokinen. Niveaus van IL-5, IL-8 en IL-23 werden in deze vroegere studie niet gemeten.
Beperkingen van onze huidige studie omvatten het feit dat het rapporteert over een kleine groep. Dit is in het bijzonder belangrijk bij het overwegen van de algemene toepasbaarheid van ons statistisch klassificatie-model. De hoop is dat deze subgroep individuen ietwat representatief is voor een grotere PI-CVS patiënten-populatie. CVS staat bekend om zijn heterogeniteit; er kan echter worden geargumenteerd dat veel hiervan het resultaat is van een gevarieerde etiologie en onbekende triggers. Onze resultaten zijn afgeleid uit een prospektieve studie en vormen een belangrijke eerste kijk op de molekulaire fenotypering van aanhoudende vermoeidheid in een groep met een uniforme en gekende infektueuze trigger; namelijk infektueuze mononucleose. Hoewel deze trigger niet alle presentaties van CVS verklaart, vertegenwoordigt het wel een significante subgroep patiënten (in het bijzonder in de pediatrische populatie). Bovendien zouden, hoewel specifiek voor het EBV-pathogen, elementen die hier worden gepresenteerd ook relevant kunnen zijn voor andere vormen van CVS met een infektueuze etiologie. Begrenzingen zoals deze benadrukken verder het belang van prospektieve studies en de nood aan veel grotere initiatieven van dit type, bij deze en bij verwante patiënten-populaties.
Besluit
Het co-expressie profiel van 5 op 16 cytokinen gemeten in het plasma van individuen gerecruteerd in een 2 jaar durende prospektieve studie bij door mononucleose geïnduceerde Chronische Vermoeidheid Syndroom onderscheidt gemakkelijk CVS-gevallen van herstelde controle-individuen en beschrijft een atypische immuun-respons bij deze individuen. In het bijzonder: er werden onregelmatige patronen van co-expressie van IL-6, IL-8 en IL-23 geïdentificeerd d.m.v. twee verschillende statistische methodologieën. Deze verschillen waren vooral merkbaar in de context van IL-1a, IL-2 en IFN-γ. Dit bewijsmateriaal wijst in de richting van een mogelijke ontregeling van de voorbereiding door het aangeboren immuunsysteem van de gepaste adaptieve Th17 respons bij deze individuen.
————————-
T helper 17 cellen (Th17) zijn een subgroep T helper cellen die pro-inflammatoir interleukine 17 (IL-17; recruteert o.a. monocyten en neutrofielen naar inflammatie-sites door verhoogde chemokine-produktie) produceren. Verhoogde aantallen (ongecontroleerde of ongepaste Th17 aktivatie) zouden een belangrijke rol spelen bij auto-immune ziekten (bv. M.S., psoriasis, juveniele diabetes, reumatoïde arthritis, Crohn’s, …). Ze hebben echter ook een belangrijke funktie bij anti-microbiële immuniteit. Ze maken ook cytokinen aan (zoals interleukine 22) dat epitheliale cellen stimuleert om anti-microbiële eiwitten te produceren om bepaalde types micro-organismen (bv. Candida & Staphylococcus) op te ruimen. Een ernstig gebrek aan Th17 cellen kan leiden tot opportunistische infekties.
