Lees, ter introductie, o.a. nog es ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’…

Epigenetica betreft de chemische wijzigingen die voorkomen op het DNA van onze genen – dikwijls het toevoegen van/ binden met methyl (CH₃)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide). – die veranderen hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA).

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS’ (de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757). Nu werden hier 12.608 verschillen op het DNA (“differentieel gemethyleerde sites”) gevonden bij M.E.(cvs)-patiënten in vergelijking met gezonde mensen; een groot biologisch verschil. Deze verschillen op het DNA beïnvloeden ook de werking van immuniteit-cellen. Er werd meer hyper-methylatie gevonden bij de M.E.(cvs)-patiënten (71,6% t.o.v. 28,4% hypo-methylatie) vergeleken met controles. 1.600 differentieel gemethyleerde genen waren gelinkt met lichamelijke stoornissen (RAND-36 score) bij M.E.(cvs). Vele van deze genen zijn betrokken bij cellulaire energie-produktie, metabolisme en immuun-signalisering.

Er werd ook bekeken of deze verschillen een invloed hadden op de immuun-funktie. Daartoe werden cellen uit het bloed onderworpen aan een specifieke test waarbij de immuuncellen worden geaktiveerd (simulatie van een immuun-respons) en deze respons dan wordt gestopt met een synthetische vorm van cortisol. Bij een subgroep M.E.(cvs)-patiënten waren de cellen hyper-sensitief voor cortisol (de hoeveelheid nodig om gezonde immuuncellen te ‘kalmeren’ veroorzaakte bij M.E.(cvs) dat deze cellen werden uitgezet. Er waren differentieel gemethyleerde genen geassocieerd met deze hyper-sensitiviteit voor cortisol.

Eens te meer wordt hier aangegeven dat M.E.(cvs) een biologische oorzaak heeft… De auteurs: “Deze bevindingen komen overéén met ander werk die aangeven dat de energie-produktie verstoord is in de cellen van mensen met M.E.(cvs).”.

————————-

BMC Med Genomics. 23 (2017) 10: 11

Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

de Vega WC^1,2, Herrera S^1,3, Vernon SD^4,5, McGowan PO^6,7,8,9

¹Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

²Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

³Department of Biological Sciences, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA

⁴Solve ME/CFS Initiative, Los Angeles, CA, USA

⁵Present affiliation: The Bateman Horne Centre of Excellence, Salt Lake City, UT, USA

⁶Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, M1C 1A4, Canada

⁷Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

⁸Department of Psychology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

⁹Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

Samenvatting

Achtergrond: Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende idiopathische ziekte die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verdwijnt door voldoende rust. De diagnose is gebaseerd op een lijst symptomen en uitsluiting van andere vermoeidheid-gerelateerde gezondheid-aandoeningen. Ondanks de heterogene patiënten-populatie komen verschillen qua immuniteit en de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, zoals versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden, steeds terug in M.E./CVS-studies. Het is geweten dat epigenetische modificaties, zoals CpG-methylatie [DNA-methylatie komt voornamelijk voor op de cytosines van CpG dinucleotide sites], lange-termijn fenotypische verschillen reguleren en eerder werk door ons groep toonde DNA-methyloom [het geheel van DNA-methylaties in een genoom] verschillen bij M.E./CVS; het verband tussen DNA-methyloom modificaties, klinische en funktionele karakteristieken geassocieerd met M.E./CVS werd echter niet onderzocht.

Methodes: We onderzochten het DNA-methyloom in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van een grotere groep vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (‘Illumina Human Methylation 450 BeadChip Array’ [‘chip’ waarmee > 485.000 methylatie-sites per staal kunnen worden geanalyseerd]). Parallel met de analyse van het DNA-methyloom, bekeken we de glucocorticoïden-gevoeligheid ‘in vitro’ door het stimuleren van PBMCs met fyto-haemagglutinine [PHA] en onderdrukten de groei met dexamethason [synthetisch glucocorticoid]. We gingen DNA-methylatie verschillen na d.m.v. bisulfiet-pyrosequentie-bepaling [‘pyrosequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling] en statistische permutatie. Er werd lineaire regressie [statistische analyse] toegepast om epigenomische gebieden geassocieerd met zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit te ontdekken, en netwerk-analyse van gen-ontologische termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] om de resultaten in een biologische context te plaatsen.

Resultaten: We detekteerden 12.608 verschillende gemethyleerde plaatsen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voornamelijk gelokaliseerd in genen m.b.t. het cellulair metabolisme; enkele daarvan waren ook gerelateerd met scores van zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit. Bij de M.E./CVS-patiënten was glucocorticoid-sensitiviteit geassocieerd met differentiële methylatie op 13 loci. [locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt]

Besluiten: Onze resultaten geven aan dat DNA-methylatie modificaties in het cellulair metabolisme bij M.E./CVS – ondanks een heterogene patiënten-populatie – deze processen in immune en HPA-as dysfunktie bij M.E./CVS impliceren. Modificaties op epigenetische loci geassocieerd met verschillen qua glucocorticoid-gevoeligheid kunnen belangrijk zijn als biomerkers. Globaal genomen komen deze bevindingen overéén met werk dat wijst op stoornissen bij de cellulaire energie-produktie in deze patiënten-populatie.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een idiopathische ziekte gekenmerkt door ernstige en invaliderende vermoeidheid, cognitieve stoornissen, niet-verfrissende slaap, autonome verschijnselen en post-exertionele malaise. Andere ziekten of gezondheid-aandoeningen die de persistente aanwezigheid van vermoeidheid kunnen verklaren, zoals majeure depressie, anorexie en boulimie, worden uitgesloten voor het stellen van de diagnose M.E./CVS. De heterogeniteit wat betreft de klinische kenmerken van M.E./CVS is een obstakel bij het bepalen van de biologische oorzaak.

Veel studies die de pathofysiologie van M.E./CVS onderzochten, hebben wijzigingen in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as gerapporteerd. De HPA-as is een belangrijke component van het neuro-endocrien systeem dat homeostatische processen, het circadiaans ritme en stress-responsen reguleert via een hormonen-cascade die leidt tot de afgifte van glucocorticoïden (GCs). GCs interageren met de GC-receptor (GR) om de stress-respons en inflammatie te reguleren. M.E./CVS-patiënten vertonen een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback responsen op GCs, wat een belangrijke rol van de HPA-as bij deze ziekte suggereert.

Naast de veranderde werking van de HPA-as, werden ook wijzigingen qua immuun-fenotype alom gedocumenteerd bij M.E./CVS. Hoewel de specifieke patronen van de verschillen nog niet zijn opgelost, bleek M.E./CVS geassocieerd met abnormale cytokine-profielen, lymfocyten-proporties en verstoorde immuun-funktie (in het bijzonder verminderde cytotoxiciteit). Verhoogde inflammatie in het darm-microbioom bleek ook geassocieerd met M.E./CVS. Dit omvat gedaalde diversiteit van het darm-microbioom, verschuivingen naar pro-inflammatoire bakteriële soorten en een proliferatie van merkers voor pro-inflammatoire processen in het serum [Giloteaux L, Goodrich JK, Walters WA, Levine SM, Ley RE, Hanson MR. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30].

Epigenetische modificaties, inclusief de methylatie van DNA op CpG-dinucleotiden, kan lange-termijn fenotypische veranderingen beïnvloeden in respons op externe stimuli. DNA-methylatie modificaties in genen betrokken bij de HPA-as en het immuunsysteem bleken sterk gelinkt met omgeving-stress. We documenteerden eerder DNA-methyloom abnormaliteiten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van ‘sudden-onset’ M.E./CVS-patiënten (gevalideerd via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling) [de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757]; deze abnormaliteiten waren significant geconcentreerd in genen gelinkt met immuun-regulering. Er bleven belangrijke vragen over het feit of deze epigenetische modificaties een impact hadden op de werking van immuun-cellen en hun relatie met klinische kenmerken van M.E./CVS.

In de huidige studie brachten we loci in kaart die epigenetische gemodificeerd waren in PBMCs en onderzochten hun gevoeligheid voor glucocorticoïden. Onze doelstellingen waren te bepalen hoe epigenetische patronen in verband staan met HPA-as signalisering in immuun-cellen bij M.E./CVS-patiënten, en de identificatie van neuro-immune mechanismen die waren beïnvloed bij M.E./CVS.

Methodes

Criteria voor selektie van deelnemers

[…] De diagnose M.E./CVS werd gesteld op basis van de Fukuda en Canadese criteria. […] Vragenlijsten over symptomen, medicatie en medische geschiedenis, en de RAND-36 voor zelf-rapportering over gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit. [36 items ter beoordeling van 8 gezondheid-concepten: lichamelijk funktioneren, beperkingen veroorzaakt door fysieke gezondheid problemen, beperkingen veroorzaakt door emotionele problemen, sociaal funktioneren, emotioneel welzijn, energie/vermoeidheid, pijn & algemene gezondheid percepties] […] We selekteerden vrouwen voor deze studie. […] 49 M.E./CVS-patiënten en 25 gezonde controles voldeden aan de volgende criteria: 1) negatief voor HIV, AIDS en/of hepatitis-C, en 2) blanke non-obese vrouwen (BMI < 30) die geen immunomodulerende en/of epigenetisch aktieve medicatie gebruikten. […]

Isolatie en bewaring van PBMCs

[…]

DNA Extractie en zuivering van genomisch DNA

[…]

DNA-methyloom chips

[…]

Normalisatie en statistische analyses va, DNA-methyloom gegevens

[…]

DNA-methylatie validering via by bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

[…]

Dexamethason-suppressie test en verband met DNA-methylatie verschillen

[…]

Associatie tussen klinische gegevens en DNA-methylatie

[…]

Resultaten

RAND-36 scores significant lager bij M.E./CVS-patiënten

Globaal hadden de M.E./CVS-patiënten een lagere gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit dan de gezonde controles (significant lager voor 7 van 8 RAND-36 categorieën (alle p-waarden ≤ 0.05). Er waren geen verschillen qua gemiddelde leeftijd of BMI. […] Verdere analyse toonde een duidelijke scheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles […].

DNA-methyloom verschillen bij M.E./CVS

We vonden – na correctie voor leeftijd, BMI en verschillen qua in cel-proporties – 12.608 significant verschillend gemethyleerde loci in onze groep. 5.544 daarvan waren toegekend aan een gekend proteïne-coderend gen (UCSC Genome Browser). […] In termen van de richting van de methylatie-verschillen bij de M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, waren 71,6% van de differentieel gemethyleerde sites hyper-gemethyleerd en 28,4% hypo-gemethyleerd. […] Hoewel er geen significante verschillen waren qua proportie hypo-/hyper-gemethyleerde sites volgens genetische lokatie, waren er significante verschillen wat betreft deze proporties wanneer de afstand van een CpG-eiland in acht werd genomen. De hoeveelheid hyper-methylatie daalde naar gelang de afstand tot een CpG-eiland vergrootte. […]

Glucocorticoïden-gevoeligheid in PBMCs bij bij M.E./CVS-subgroepen

Globaal genomen was er een significant gemiddelde toename qua glucocorticoïden-sensitiviteit in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (p ≤ 0.05). Een visuele inspectie van de gegevens onthulde een bimodale verdeling van de glucocorticoïden-gevoeligheid binnen de M.E./CVS-groep: een GC-hypersensitieve groep (die een verhoogde respons op glucocorticoid-behandeling vertoonde t.o.v. de gemiddelde controle) en een GC-typische groep (die een respons vertoonde gelijkaardig met de gezonde controles). De verschillen qua GC-sensitiviteit waren niet geassocieerd met het type M.E./CVS-aanvang of de RAND-36 (scores voor de ganse vragenlijst of bepaalde categorieën; p > 0.10).

DNA-methylatie verschillen in dexamethason-test subgroepen via pyrosequentie-bepaling en permutatie-testen

Om het verband te bepalen tussen verschillen qua DNA-methylatie en glucocorticoïden-gevoeligheid, pasten we dezelfde statistische criteria toe die werden gebruikt om methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te identificeren toe op 3 verschillende vergelijkingen: 1) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch; 2) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles; en 3) M.E./CVS GC-typisch vs. controles. We vonden dat er geen methylatie-verschillen voldeden aan deze statistische criteria. Een groot aantal loci vertoonden echter significant nominale p-waarden ≤ 0.05 [De ‘significantie’ is een nominale p-waarde die de researcher selekteert als ‘cut-off’ punt voor het interpreteren of iets statistisch significant ka worden beschouwd of niet.]. Als alternatieve methodes voor statistische analyse van de 3 glucocorticoïden-gevoeligheid vergelijkingen, evalueerden we de verschillen die werden gevonden met de ‘450K array’ via 2 doelgerichte statistische methodes.

Wat betreft de pyrosequentie-bepaling analyse was onze strategie het selekteren van 3 loci die nominaal significante verschillen vertoonden tussen M.E./CVS GC-hypersensitief en M.E./CVS GC-typisch: 2 loci in JRK [gen coderend voor een proteïne lijkend op DNA-bindende proteïnen] & 1 locus in SLC6A4 [codeert voor de serotonine-transporter]. Deze sites werden gekozen om de betrouwbaarheid te onderzoeken van de ‘450K array’ om significante verschillen te detekteren zowel boven als onder de 5% cut-off die we implementeerden bij het zoeken naar significant differentieel gemethyleerde plaatsen bij M.E./CVS, en om DNA-methylatie verschillen te valideren die zowel potentieel gerelateerd zijn met GC-sensitiviteit verschillen, alsook uniek voor M.E./CVS. De JRK-sites weden geselekteerd voor de volgende redenen: ze waren bij de top sites in termen van verschil-grootte > 5% methylatie-verschil op de ‘450K array’ […] en ze lagen ook dicht bijéén in het genoom (5 bp uit elkaar), wat ons toeliet af te leiden hoe de DNA-methylatie status wordt gereflekteerd binnen hetzelfde gen-gebied. […] Na pyrosequentie-bepaling werden de JRK-sites significant verklaard (p ≤ 0.05) of ‘trending’ (p ≤ 0.10) naargelang de resultaten. Het < 5% nominaal significant verschil gevonden op de ‘450K array’ gegevens voor SLC6A4 was hier echter niet significant; wat er op wijst dat methylatie-verschillen < 5% op de ‘450K array’ niet op een betrouwbare manier werden gedetekteerd voor deze vergelijkingen.

Wat betreft de permutatie-analyse [een type statistische significantie-test] onderzochten we de mate van overlapping tussen de sites met een > 5% gemiddeld methylatie-verschil die nominaal significant waren op de ‘450K array’ […] en de sites die significant verschillende werden verklaard bij 10.000 permutaties. We vonden dat een meerderheid van de nominaal significanten ook significant waren volgens de permutatie-test: 76,8% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch, 84,5% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles, en 99,6% bij de vergelijking M.E./CVS GC-typisch vs. controles; wat er op wijst dat de meerderheid van de methylatie-verschillen die nominaal significant waren met > 5% gemiddeld methylatie-verschil waarschijnlijk differentiële methylatie reflekteerden.

Gezien deze resultaten implementeerden we de 5% verschil cut-off voor de verschillende dexamethason-test subgroep-vergelijkingen, en onderzochten sites die significant bleken […]. Om potentiële epigenomische loci geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit te bepalen, onderzochten we de overlap qua nominaal significante loci voor de 3 vergelijkingen. Er waren 5 sites die differentieel gemethyleerd waren bij de 3 vergelijkingen; één die correspondeerde met een coderend gen: NPAS3 [transcriptie-factor ‘Neuronal PAS domain protein 3’], een gen betrokken bij neurogenese. We vonden 13 loci die differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles én M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch. Deze loci […] zijn waarschijnlijk geassocieerd met glucocorticoïden-gevoeligheid. De top 3 sites met de grootste verschillen bij vergelijking van M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch correspondeerden met GSTM1 [Glutathion S-transferase Mu 1] (14,3% verhoogde methylatie), MYO3B [myosine IIIB] (13,7% stijging) en GSTM5 [Glutathion S-transferase Mu 5] (12,0% stijging). Naast deze glucocorticoïden-sensitieve sites vonden we 4.699 loci die waarschijnlijk geassocieerd zijn met M.E./CVS, aangezien ze differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles en de M.E./CVS GC-typisch vs. controles vergelijkingen. GO-analyse van deze sites onthulde een aanrijking van differentiële methylatie bij M.E./CVS geassocieerd met regulerende processen, inclusief neuronale cel ontwikkeling, signaal-transductie, metabole regulering en transcriptie-regulering. Er waren 203 significant differentieel gemethyleerde sites die uniek waren voor M.E./CVS GC-typische individuen maar er waren echter geen GO-termen significant geassocieerd met deze sites.

Verbanden tussen differentieel gemethyleerde gebieden en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

Om het verband te onderzoeken tussen DNA-methylatie en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit […] onderzochten we gen-gebieden om potentiële epigenomische plaatsen te bepalen die een significante relatie vertonen met levenskwaliteit-scores. Na lineaire regressie analysis vonden we meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden met een > 5% methylatie-verschil (M.E./CVS en controles) die een significant verband vertoonden met de globale RAND-36 score. De top 5 differentieel gemethyleerde gebieden correspondeerden met TSS-methylatie [TSS = ‘transcription start site’; plaats waar de transcriptie start] in GRAMD1A [‘GRAM Domain Containing 1A’], ATP6V0E2 [‘ATPase H⁺ Transporting V0 Subunit E2’] & LOC144571 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne], en gen-‘body’ methylatie [in het gen zelf] in LOC401431 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne] & IL6R [IL-6 receptor].

Bespreking

In deze studie detekteerden we 12.608 differentieel gemethyleerde sites in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles, sommige daarvan waren significant geassocieerd met scores van zelf-gerapporteerde levenskwaliteit. 71,6% van deze sites vertoonden hyper-methylatie bij M.E./CVS en de hyper-methylatie bleek te delen naar gelang de afstand van een CpG-eiland steeg; dit suggereert dat epigenetische ontregeling bij M.E./CVS significant varieert afhankelijk van de relatieve plaats t.o.v. CpG-eilanden [gebieden waar veel CpG-sites voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 bp met een GC-percentage > 50%]. Binnen de groep M.E./CVS-patiënten zagen we 2 subgroepen op basis van de in vitro [‘in een proefbuis’] sensitiviteit voor blootstelling aan glucocorticoïden. Het verschil qua glucocorticoïden-gevoeligheid was geassocieerd met differentiële methylatie op 13 sites (op basis van vergelijkingen van differentiële methylatie bij M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. M.E./CVS GC-typisch en M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. gezonde controles).

DNA-methylatie modificaties in cellulaire processen/metabolisme-mechanismen bij M.E./CVS

Genen geassocieerd met cellulaire en metabole regulering waren belangrijke mechanismen met differentiële epigenetische profielen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Deze bevindingen zijn consistent met een eerder rapport van onze groep bij M.E./CVS-patiënten waarbij de ziekte plots startte [zie link/ref. in onze inleiding] en met andere rapporten over genomische, transcriptomische en metabolomische verschillen bij M.E./CVS [Carmel L, Efroni S, White PD, Aslakson E, Vollmer-Conna U, Rajeevan MS. Gene expression profile of empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 375-86 /// Presson AP, Sobel EM, Papp JC, Suarez CJ, Whistler T, Rajeevan MS, Vernon SD, Horvath S. Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst Biol. (2008) 2: 95 /// Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405 /// Naviaux RK, Naviaux JC, Li K, Bright AT, Alaynick WA, Wang L, Gordon E. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences (2016) 113: E5472-E5480], die een rol aangeven voor DNA-methylatie modificaties bij de metabole stress die wordt vastgesteld bij deze ziekte. Oxidatieve en nitrosatieve stress werden gedocumenteerd in immuuncellen van M.E./CVS-patiënten, en een daling van metabolieten van de elektronen-transport-keten suggereert een rol in de M.E./CVS-pathologie voor processen die de mitochondriale werking beïnvloeden. Er is een gekend verband tussen oxidatieve stress en epigenetische modificaties. DNA-beschadigingen zijn dikwijls het resultaat van oxidatieve stress, en deze beïnvloeden op hun beurt de epigenetische regulering, wat leidt tot afwijkende DNA-methylatie en gen-expressie patronen. Het is mogelijk dat oxidatieve stress, zoals in onze studie aangegeven door de verschillen gevonden in genen betrokken bij cellulaire en metabole regulering (inclusief ARL4C & HOXA11), sommige van de epigenetische veranderingen bij M.E./CVS kunnen aansturen. Er is echter bijkomend werk – zoals het karakteriseren van het effekt van ARL4C [‘ADP-Ribosylation Factor Like Protein 4C’] & HOXA11 [transcriptie-factor ‘Homeobox protein Hox-A11’] op DNA-methylatie patronen – vereist om dit verband te onderzoeken.

Genen geassocieerd met neuronale cel ontwikkeling bleken ook een belangrijke klasse genen met differentiële methylatie bij M.E./CVS-patiënten. Ten minste 2 eerdere studies die gen-expressie patronen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten onderzochten, rapporteerden ook significante verschillen voor genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling en regulerende processen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9]. Het is ook bekend dat genen die geassocieerd zijn met psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen rijke expressie-profielen vertonen in PBMCs [Vernon SD, Nicholson A, Rajeevan M, Dimulescu I, Cameron B, Whistler T, Lloyd A. Correlation of psycho-neuroendocrine-immune (PNI) gene expression with symptoms of acute infectious mononucleosis. Brain Res. (2006) 1068: 1-6]. DNA-methylatie verschillen op neuronale genen in PBMCs kunnen sommige centrale verschillen in psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen bij M.E./CVS weerspiegelen, zoals wordt gesuggereerd door de resultaten van onze glucocorticoïden-sensitiviteit test, die overéénkomen met werk dat perifeer bloed en immuuncellen identificeert als geschikte kandidaten die differentiële DNA-methylatie in het brein weerspiegelen.

Dexamethason-respons subgroepen bij bij M.E./CVS

We stelden een gemiddelde toename qua glucocorticoïden-gevoeligheid vast bij M.E./CVS-patiënten, die niet kon worden verklaard op basis van het type M.E./CVS-aanvang of levenskwaliteit. Daarnaast onthulde een meer gedetailleerd onderzoek van onze resultaten 2 subgroepen bij de M.E./CVS-patiënten. Er werd een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden geobserveerd in meerdere studies van de GC-responsen bij M.E./CVS. De aanwezigheid van een GC-typische en GC-hypersensitieve subgroep binnen onze M.E./CVS-groep komt dus overéén met de geobserveerde heterogeniteit van HPA-gerelateerde verschillen in deze eerdere rapporten.

Glucocorticoïden staan bekend om hun anti-inflammatoire effekten en worden typisch gebruikt om immuun-responsen te onderdrukken. Een ongepaste respons op behandeling met glucocorticoïden is echter geassocieerd met verhoogde vatbaarheid voor metabole en hart-ziekten. Onze resultaten op basis van PHA, een T-cel mitogen [molekule die een cel aanzet tot delen], als immuun-stressor gaven een funktionele stoornis qua T-cel GR-gevoeligheid bij GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten aan. Bijkomend bewijsmateriaal suggereert dat T-cellen kandidaten zijn voor een primaire immuuncel-populatie bij M.E./CVS-pathologie. Bv.: een GWAS [‘genome-wide association study’] vond significante verschillen qua polymorfismen geassocieerd met T-cel receptoren bij M.E./CVS-patiënten [Schlauch KA, Khaiboullina SF, Rawat S, Petereit J, Rizvanov AA, Blatt N, Mijatovic T, Kulick D, Palotas A et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry. (2016) 6: e730]. Daarnaast werden DNA-methylatie verschillen gerapporteerd in CD4⁺ T-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brenu EW, Staines DR, Marshall-Gradisbik SM. Methylation profile of CD4⁺ T cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228], een cel-populatie die een verhoogde dexamethason-sensitiviteit lijkt te vertonen bij M.E./CVS [Visser J, Blauw B, Hinloopen B, Brommer E, de Kloet ER, Kluft C, Nagelkerken L. CD4 T-lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4].

We vonden 13 sites geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit bij in GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten in vergelijking met zowel GC-typische M.E./CVS-patiënten als gezonde controles. Naar ons weten zijn er geen andere EWAS [‘epigenome-wide association study’] of GWAS studies die specifiek de epigenetische of genetische verschillen onderzochten in de context van GC-sensitiviteit. Genomische studies bij M.E./CVS hebben echter polymorfismen in GC-signalisering genen bij M.E./CVS-patiënten gerapporteerd. Interessant: deze genen lijken niet te overlappen met andere aandoeningen die worden gekenmerkt door verstoorde GC-signalisering [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I, Unger ER, Vernon SD, Heim C, Reeves WC. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Daarnaast was FKBP5 [gen met een rol bij post-traumatische stress, depressie en angst], een gen dat differentieel gemethyleerd bleek bij het syndroom van Cushing [hormonale aandoening gekenmerkt door een verhoogd gehalte aan cortisol in het bloed], niét bij de genen die in onze studie werden geïdentificeerd. De potentiële link tussen M.E./CVS en epigenetische modificatie van deze genen zou dus echter met voorzichtigheid moeten worden bekeken. Niettemin suggereren de resultaten dat epigenetische verschillen op deze sites nuttige informatie kunnen bieden betreffende geassocieerde GC-sensitiviteit bij sommige M.E./CVS-patiënten.

6 van de 13 sites waren onderdeel van coderende genen, 4 daarvan met rollen in het cellulair metabolisme. ‘Patatin Like Phospholipase Domain Containing 4’ (PNPLA4) is een fosfolipase dat een rol speelt bij het lipiden-metabolisme en sterk tot expressie komt in metabool aktief weefsel. PNPLA4 maakt ook deel uit van de PNPLA-familie, die aktiveert na interaktie met glucocorticoïden. D-aspartaat-oxidase (DDO) is een enzyme dat D-aspartaat en N-methyl-D-aspartaat, overvloedig aanwezig in neuro-endocrien weefsel, deaminiseert. Gen ‘knock-out’ studies over DDO in muizen hebben onthuld dat dit enzyme belangrijk is bij de produktie van melanocortinen [groep of peptide-hormonen] en betrokken is bij de regulering van basale corticosteron-waarden. Fosfodiesterase-1C (PDE1C) is verantwoordelijk voor de hydrolyse van cyclische nucleotiden, wat belangrijk is voor fysiologische regulering, calcium-signalisering mechanismen en circadiaans ritme. Stiudies met cel-culturen hebben getoond dat inhibitie van PDE1C […] resulteert in geïnhibeerde cel-proliferatie en dat PDE1C geaktiveerd wordt na behandeling met dexamethason.

De top 3 sites, op basis van grootte-verschillen tussen on GC-hypersensitieve en GC-typische (M.E./CVS & controle) individuen, correspondeerden met GSTM1, MYO3B & GSTM5 [zie eerder], die alle een > 10% toename van de methylatie vertoonden. GSTM1 & GSTM5 maken deel uit van de mu-klasse van de GST genen-familie, waarvan de primaire rol detoxificatie is van milieu- en exogene toxinen, specifiek polycyclische aromatische koolwaterstoffen. Genetische polymorfismen in GSTM zijn gekende voorspellers van de potentiële respons op glucocorticoïden bij acute lymfoblastische leukemie, wat er op wijst dat GSTM een significante rol zou kunnen spelen bij glucocorticoïden-signalisering in immuuncellen. MYO3B is een ATPase dat geaktiveerd wordt door actine [onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en betrokken is bij kinase-aktiviteit. MYO3B en z’n meerdere interakties worden echter nog niet goed begrepen vergeleken met andere myosine-genen [van belang bij spier-samentrekking], zo dat het onduidelijk is hoe verschillen in MYO3B verband kunnen houden met glucocorticoïden-signalisering.

De 13 differentie gemethyleerde sites zouden als biomerkers voor of glucocorticoïden-hypersensitiviteit beschouwd kunnen worden maar er is echter nog bijkomend werk vereist om de funktionele impact van hyper-methylatie op deze genen en het verband met glucocorticoïden-signalisering te begrijpen en te bevestigen. Gen ‘knock-out’ en RNA ‘knock-down’ studies kunnen helpen bij het bepalen van de precieze impact die deze genen op glucocorticoïden-signalisering hebben. Het meten van mRNA-transcripten, methylatie-verschillen en proteïne-waarden van deze genen bij baseline, PHA-gestimuleerd en DEX-onderdrukt in vitro en in vivo, kunnen tot een beter begrip van de dynamiek die aan de basis ligt van GC-sensitiviteit verschillen bij M.E./CVS leiden.

DNA-methylatie modificaties geassocieerd met levenskwaliteit-scores

We vonden meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden die significant geassocieerd waren met de globale RAND-36 score, waarbij variatie in methylatie in deze gebieden significant was geassocieerd met variatie in de globale RAND-36 score. De scores van deze vragenlijst kunnen wijzen in de richting van veranderingen in biologische systemen. Van de top 5 differentieel gemethyleerde gebieden [zie ‘resultaten’] vermelden we de volgende. ATP6V0E2 is een isoform van de H⁺-ATPase V0 e subunit (belangrijk is voor cellulaire energie [ATPases pompen protonen (H⁺) doorheen de plasma-membranen van talrijke cel-types]), LOC401431 codeert de het antisense RNA voor ATP6V0E2 (suggererend dat de regulering-dynamiek van dit gen beïnvloed zou kunnen zijn bij M.E./CVS), IL6R codeert voor de IL-6 receptor (een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend]) en LOC144571 is het antisense RNA [inaktiveert het mRNA] voor alfa-2-macroglobuline (een protease-inhibitor en cytokine-transporter). De lage ‘Physical Health’ scores bij de M.E./CVS-patiënten suggereren dat de lichamelijke stoornissen bij M.E./CVS geassocieerd zijn met een epigenetisch onevenwicht qua cellulaire energie, metabolisme en immuun-signalisering.

Besluiten

We rapporteren hier DNA-methylatie verschillen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, waarvan sommige significant geassocieerd waren met de globale levenskwaliteit alsook met glucocorticoïden-hypersensitiviteit in een subgroep M.E./CVS-patiënten. We bepaalden epigenetische loci geassocieerd met verschillen in glucocorticoïden-sensitiviteit die de onderliggende M.E./CVS-pathologie van sommige patiënten kan weerspiegelen. Er is bijkomend werk vereist om de mogelijke mechanistische verbanden tussen DNA-methylatie in deze genen, gen-expressie en proteïne-profielen, en M.E./CVS-fenotype te bevestigen. Er zijn longitudinale studies (zowel in vivo als in vitro) nodig om de stabiliteit te bepalen van deze epigenetische modificaties, inclusief veranderingen qua symptoom-profielen en in respons op behandeling met glucocorticoïden. Bv.: cytokines zoals IL-10 & IFN-gamma, die differentieel gemethyleerd bleken in onze studie, staan bekend om hun interaktie met GR en vertonen expressie-verschillen in vitro na dexamethason-behandeling [Visser J, Graffelman W, Blauw B, Haspels I, Lentjes E, de Kloet ER, Nagelkerken L. LPS-induced IL-10 production in whole blood cultures from Chronic Fatigue Syndrome patients is increased but supersensitive to inhibition by dexamethasone. J Neuroimmunol. (2001) 119: 343-9]. Hoewel GR-densiteit en binding-affiniteit in PBMCs van M.E./CVS niet lijken te verschillen qua ‘steady-state’ [evenwicht-toestand] condities, staat GR bekend om z’n upregulering tijdens inspanning bij M.E./CVS [Meyer JD, Light AR, Shukla SK, Clevidence D, Yale S, Stegner AJ, Cook DB. Post-exertion malaise in Chronic Fatigue Syndrome: symptoms and gene expression. Fatigue (2013) 1: 190-204]. Toekomstig werk zou DNA-methylatie signaturen moeten onderzoeken tijdens inspanning bij M.E./CVS om de dynamiek van glucocorticoïden-signalisering beter te kunnen begrijpen. Niettemin kunnen de differentieel gemethyleerde sites die in deze studie werden geïdentificeerd op z’n minst belangrijk zijn als biomerkers voor toekomstige klinische testen om te bepalen of epigenetische wijzigingen in deze genen verband houden met ziekte-aanvang of -progressie.

De resultaten van deze studie onderlijnen het potentieel nut van immuuncel-subtypering binnen de M.E./CVS-populatie en geven aan dat epigenetische gegevens kunnen helpen bij het ophelderen van relevante biologische mechanismen die bij M.E./CVS beïnvloed zijn. Klinisch onderzoek naar de regulering van het cellulair metabolisme is nodig om deze mogelijkheid te beoordelen, aangezien we vonden dat genen zoals GSTM1, MYO3B, GSTM5 & ATP6V0E2 significante epigenetische modificaties vertoonden bij M.E./CVS. Een beter begrip van M.E./CVS-subtypes zal patiënten en artsen helpen de geschikte interventies te bepalen om symptomen te behandelen en de gezondheid te verbeteren.