Immuunglobulinen (Ig) herkennen vreemde antigenen en initiëren immuun-responsen (zoals fagocytose en het complement-systeem). Elk immunoglobuline-molekule bestaat uit twee identieke zware-ketens en twee identieke lichte-ketens. Het immuunsysteem heeft de capaciteit om oneindig veel verschillende antigeen-bindende receptoren te produceren. Dit wordt mogelijk gemaakt door molekulaire en cellulaire mechanismen die een groot aantal individuele receptor-molekulen kunnen genereren en enkele selekteren voor verdere uitbreiding (‘expansie’). De diversificatie waarop het repertoire is gebouwd is de genetische herschikking/samenvoeging van gecodeerde variabelen. Tijdens de ontwikkeling van B-cellen (immunoglobuline-producerende witte bloedcellen) gebeurt recombinatie op DNA-niveau. Variabele gebieden van de zware keten van immunoglobuline (IGH) worden gevormd door het verbinden van drie gen-segmenten die op het gen-locus liggen: IGHV (variabel), IGHD (diversiteit) & IGHJ (‘joining’).

Elk type IGH gen-segmenten (op chromosoon-14) zijn polygeen én polymorf. In de menselijke populatie kan elk gen bestaan als een aantal varianten (allelen) en elk individu draagt één (homozygoot) of twee (heterozygoot) van de mogelijke allelen. Elk individu kan ook twee varianten van sommige genen dragen (‘copy-number’ variant).

De vorming van het herschikt immunoglobuline variabel gen (dat uiteindelijk zal worden overgeschreven naar het IGH-RNA) begint met het verbinden van enkele IGHD- & IGHJ-segmenten (ca. 25 IGHD- & 6 IGHJ-segmenten op het IGH-locus van een individu). Daarna koppelt dit IGHD:IGHJ met één van de 45 tot 50 funktionele IGHV-segmenten tot één bepaald herschikte IGH variabel gebied gen. De recombinatie van selekte gen-segmenten om de uiteindelijke gen-sequentie te genereren kan ca. 22.500 unieke IGH herschikkingen opleveren. Er bestaat echter ook een tendens bij bepaalde segmenten op preferentieel te linken met elkaar (‘vooringenomenheid’/bias) wat het repertoire doet ‘overhellen’ (‘skew’) in een bepaalde richting…

In onderstaand artikel wordt gerapporteerd dat M.E./CVS wordt gekenmerkt door een ‘skewed’ B-cel receptor genen gebruik. Upregulering van specifieke IGHV-genen is gecorreleerd met infektie-gerelateerde episodes bij aanvang van de ziekte. Plasmablasten (‘onrijpe’ Ig-procucerende B-cellen die verder differentiëren tot plasmacellen, na aktivatie door een T_helper-cel) van M.E./CVS-patiënten met die genen coreleerden met interferon-respons genen. De analyse van het B-cel receptor repertoire kan volgens de auteurs een nuttige diagnostische merker voor M.E./CVS zijn.

————————-

Brain, Behavior & Immunity. 2021 (pre-print)

Skewing of the B cell receptor repertoire in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Wakiro Sato (1), Hirohiko Ono (2), Takaji Matsutani (3), Masakazu Nakamura (2), Isu Shin (4), Keiko Amano (5), Ryuji Suzuki ( 3), Takashi Yamamura (6)

1 Department of Immunology, National Institute of Neuroscience, National Centre of Neurology and Psychiatry (NCNP), Tokyo, Japan; Multiple Sclerosis Centre, National Centre Hospital, NCNP, Tokyo, Japan

2 Department of Immunology, National Institute of Neuroscience, National Centre of Neurology and Psychiatry (NCNP), Tokyo, Japan

3 Repertoire Genesis Incorporation, Ibaraki, Japan

4 Sekimachi Medical Clinic, Tokyo, Japan

5 Seifuso Hospital, Saitama, Japan

6 Department of Immunology, National Institute of Neuroscience, National Centre of Neurology and Psychiatry (NCNP), Tokyo, Japan; Multiple Sclerosis Centre, National Centre Hospital, NCNP, Tokyo, Japan

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening gekenmerkt door vermoeidheid en post-exertionele malaise, vergezeld door verscheidene tekenen van neurologische en autonome dysfunktie. M.E./CVS wordt dikwijls getriggerd door een infektueuze episode en is geassocieerd met een afwijkend immuunsysteem. Hier rapporteren we dat M.E./CVS een aandoening is die wordt gekarakteriseerd door scheefgetrokken gebruik van B-cel receptor genen. Door toepassing van ‘next-generation’ sequentiebepaling om de IGHV/IGHD/IGHJ-repertoires te bepalen, onthulden we een vooringenomen gebruik van meerdere IGHV-genen in perifeer-bloed B-cellen van M.E./CVS-patiënten. Resultaten van ‘receiver operating characteristic’ (ROC) analyse duiden verder op een mogelijkheid tot het onderscheiden van patiënten van gezonde controles, op basis van het scheefgetrokken B-cel repertoire. Ondertussen waren B-cel klonen die IGHV3-30 & IGHV3-30-3 genen gebruiken meer frequent in patiënten met een kennelijke infektie-gerelateerde episode bij aanvang, en correleerden met expressie-waarden van interferon-respons genen in plasmablasten. Te samen genomen impliceren deze resultaten dat B-cel responsen bij M.E./CVS gericht zijn tegen een infektueus agens of antigenen geïnduceerd vóór ziekte-aanvang.

1. Inleiding

[…] Bevindingen geven de betrokkenheid aan van neuro-inflammatie met immune abnormaliteiten bij M.E./CVS, inclusief B-cel abnormaliteiten, gewijzigde B-cel subsets [Bradley AS et al. Altered functional B cell subset populations in patients with Chronic Fatigue Syndrome compared to healthy controls. Clinical & Experimental Immunology (2013) 172: 73-80 /// Ramos S et al. Characterisation of B cell subsets and receptors in Chronic Fatigue Syndrome patients. Journal of Clinical & Cellular Immunology (2015) 16: 35 /// Mensah F et al. Extended B cell phenotype in patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: a cross‐sectional study. Clinical & Experimental Immunology (2016) 184: 237-247], verstoorde B-cel differentiatie en overleving [Nguyen CB et al. Whole blood gene expression in adolescent Chronic Fatigue Syndrome: an exploratory cross-sectional study suggesting altered B cell differentiation and survival. Journal of Translational Medicine (2017) 15: 102], en aanwezigheid van auto-antilichamen tegen β-adrenerge of muscarine cholinerge receptoren [Loebel M et al. Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain, Behavior & Immunity (2016) 52: 32-39 /// Yamamoto S et al. Reduction of [11C](+)3-MPB binding in brain of Chronic Fatigue Syndrome with serum autoantibody against muscarinic cholinergic receptor. PLoS One (2012) 7: e51515.].

Elke B-cel brengt één enkel B-cel receptor (BCR) tot expressie en de diverse BCR die door de totale B-cel populatie van een individu tot expressie wordt gebracht, wordt het “BCR-repertoire” genoemd. Een ‘skewing’ [scheeftrekking/vervorming/vertekening] van het BCR-repertoire is gecorreleerd met microbiële interakties, vaccinaties of immuun-gemedieerde ziekten, zoals Systemische Lupus Erythematosus of Multipele Sclerose. ‘Next-generation’ sequentiebepaling (NGS) technologie maakt de uitgebreide kwantitatieve analyse van BCRs op klonaal niveau mogelijk. […]. In de huidige studie voerden we een uitgebreide BCR-repertoire analyse uit om met ziekte gerelateerde scheeftrekking van het BCR-repertoire te detekteren.

2. Methodes

2.1. Ethische verklaring

[…]

2.2. Studie-deelnemers

Alle M.E./CVS-patiënten voldeden aan de Fukuda criteria, Canadese criteria & internationale consensus criteria. Patiënten met aktieve auto-immune ziekte, die immunosuppressieve medicijnen of steroïden kregen, af met aktieve allergieën of infektueuze ziekten werden uitgesloten. […] Er werd B-cel subset analyse uitgevoerd op perifeer bloed van Groep 1 (M.E./CVS n = 61 [gemiddelde leeftijd 39,5 jaar; gemiddelde ziekteduur 9,8 jaar], HC n = 23); BCR-repertoire analyse op bloed willekeurig geselekteerde patiënten uit deze groep (M.E./CVS n = 38 [gemiddelde leeftijd 38,8 jaar; gemiddelde ziekteduur 10,8 jaar], HC n = 23). Om de resultaten van de BCR-repertoire analyse te valideren, werden nieuwe M.E./CVS-patiënten gerecruteerd: Groep 2 (M.E./CVS n = 38 [gemiddelde leeftijd 36,6 jaar; gemiddelde ziekteduur 8,1 jaar]) […]. […] De ernst van M.E./CVS werd geëvalueerd d.m.v. de ‘performance’ status (PS [prestatie-status; niet verder verduidelijkt]) score; 0 tot 9, waarbij 9 de ernstige vorm van M.E./CVS is [gemiddelde PS Groep 1 = 5,7 – Groep 2 = 5,6].

2.3. Flow-cytometrie

[…] Kleuring met fluorescerende geconjugeerde monoklonale antilichamen (mAbs) […]; voor B-cel subset analyse: anti-CD19-allofycocyanine (APC)-cyanine 7 (Cy7), anti-CD3-V500, anti-CD14-V500, anti-CD27-V500 & anti-CD27-phycoerythrine (PE)-Cy7; anti-CD180-PE; anti-CD38-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) & muizen IgG1-FITC; anti-CD14-APC, IgG2b-APC, anti-CD27-‘Pacific Blue’, muizen IgG2Aκ-‘Pacific Blue’, anti-CD3-peridinin-chlorofyl-proteïne (PerCp)-cyanine 5.5 (Cy5.5), anti-CD38-PerCp-Cy5.5, anti-CD40-PE-Cy7 & anti-muizen IgG1-PE-Cy7. We definieerden plasmablast (PB) populaties als CD19+CD27+CD180-CD38high. […]

2.4. BCR-repertoire analyse

[…] RNA-isolatie, cDNA-synthese & BCR-sequentiebepaling. […] De BCR-diversiteit & -klonaliteit werden geëvaluaeerd [d.m.v. berekende indexen] […]. Hoe groter de index, hoe meer divers de BCR-kloon [kloon = groep identieke cellen die een gemeenschappelijke afkomst delen]. De gelijkmatigheid (onpartijdigheid) van het BCR-repertoire werd ook geanalyseerd [berekening van diversiteit-indexen].

De IGH V, D & J [zie onze inleiding] gen-expressie werd berekend […].

2.5. Cel-sortering

Geïsoleerde PBMCs werden gekleurd met anti-CD3-V500, anti-CD14-V500, anti-CD19-APC-Cy7, anti-CD27-‘Pacific Blue’, anti-CD180-PE & anti-CD38-PerCP-Cy5.5. Plasmablasten (CD19+CD27+CD180-CD38high) werden gesorteerd d.m.v. een FACS [fluorescentie-geaktiveerde cel-sortering; scheiding van cel-populaties na labeling/’kleuring’ met een fluorescent antilichaam].

2.6. Gen-expressie analyse (nCounter test)

[…] RNA-extractie uit gesorteerde cellen, gen-expressie analyse ([…] 594 menselijke genen die tot expressie komen in het immuunsysteem en 15 interne referentie-genen ). […] De gen-expressie werd geanalyseerd indien de expressie-waarden 10 ‘reads’ [een ‘read’ is het resultaat van een sequentie-bepaling (volgorde van de base-paren of nucletioden)] hadden en een > 1,25-voudige verandering t.o.v. HCs.

2.7. Kwantitatieve RT-PCR analyse

Cel-sortering & RNA extractie. Omgekeerde transcriptie tot cDNA […]. Het expressie-niveau van elk mRNA werd genormaliseerd t.o.v. β-actine [referentie-gen]. […]

2.8. Analyse van het complementariteit-bepalend gebied 3 (CDR3)

[De complementariteit-bepalende regio’s (CDRs) maken deel uit van de variabele ketens van immunoglobulinen en T-celreceptoren (die een specifiek antigeen kunnen binden). De CDRs vormen het meest variabele deel van deze antilichamen en T-celreceptoren. Ze zijn onmisbaar voor het genereren van de grote diversiteit aan antigeen-bindende molekulen van lymfocyten.]

De aminozuren-sequenties van CDR3 werden afgeleid uit de gegevens van de sequentiebepaling […].

2.9. Data-analyse & statistiek

[…] Verschillen qua gemiddelden werden als statistisch significant beschouwd wanneer p < 0.05.

2.10 Beschikbaarheid van de gegevens

[…]

3. Resultaten

3.1. Demografische kenmerken van de M.E./CVS-patiënten

[…] Er waren geen significante verschillen qua leeftijd en geslacht tussen M.E./CVS-patiënten & gezonde controles (HCs). Er werden verscheidene immuun-gerelateerde co-morbiditeiten of abnormale laboratorium-testen, zoals de aanwezigheid van anti-TPO-antilichamen [TPO = thyroperoxidase; schildklier-enzyme], gevonden bij zowat de helft van de patiënten. De co-morbide immuun-gerelateerde ziekten waren niet in een aktieve toestand en de patiënten kregen geen immunosuppressieve behandelingen of steroïden.

3.2. Scheeftrekking van het BCR-repertoire bij M.E./CVS-patënten

We voerden een BCR-repertoire analyse uit d.m.v. van ‘high-throughput’ sequentiebepaling (Groep 1). Eerst vergeleken we verscheidene diversiteit-indexen […]. Op basis daarvan vonden we echter geen significante verschillen tussen HCs en M.E./CVS-patiënten. We onderzochten of een specifieke IGHV genen-familie preferentieel werd gebruikt. De expressie van IGHV1-3, 3-30, 3-30-3 & 3-49 was significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs. De expressie van IGHD1-26 & IGHJ6 was ook significant gestegen bij de M.E./CVS-patiënten. De expressie-niveaus van IGHV3-30 & IGHV3-30-3 bleken sterk gecorreleerd bij zowel HCs als M.E./CVS-patiënten […].

3.3. Expressie van IGHV3-30/3-30-3 was geassocieerd met infektie-gerelateerde episodes

Omdat het BCR-repertoire wordt beïnvloed door microbiële interakties, evalueerden we het effekt van deze factoren via subgroep-analyse. We zagen significant verhoogde expressie van IGHV3-30-3 bij patiënten met een aanvang van M.E./CVS na een duidelijke infektie-gerelateerde episode t.o.v. deze zonder, wat suggereert dat voorafgaande infektie een toename van het aantal B-cellen dat IGHV3-30-3 tot expressie brengt kan hebben getriggerd. De expressie van IGHV3-30-3 was bovendien omgekeerd gecorreleerd met ziekteduur […], wat er op wijst dat upregulering van IGHV3-30-3 een kenmerk is van een relatief vroegere ziekte-fase.

3.4 Complementariteit-bepalend gebied (CDR3) van IgG-BCR met over-expressie

Het complementariteit-bepalend gebied 3 (CDR3) is het meest polymorfe deel van een antilichaam-struktuur en het is het gebied dat het meest intiem interageert met het antigen. Vandaar dat aminozuren (AA) met geconserveerde lengte in het CDR3-gebied indicatief zijn voor antigen-specificiteit. Om te onderzoeken of gestegen IGHV-gebruik in M.E./CVS B-cellen de weerspiegeling is van de klonale expansies resulterend uit specifieke antigene stimulaties, bekeken we de CDR3-gebied strukturen van IgG-BCR die tot expressie komen in IGHV3-30 of IGHV3-30-3 dragende B-cel klonen. We vergeleken initieel de verdeling van de CDR3-lengte bij M.E./CVS-patiënten met significant hoger gebruik van IGHV3-30 & IGHV3-30-3 (hoger dan gemiddeld + 2SD bij HCs) dan bij de 23 HCs. We vonden significant hogere frequenties bij specifieke lengtes bij dergelijke M.E./CVS-patiënten (18 AA in IGHV3-30 & 15 AA in IGHV3-30-3). Daarnaast toonde de top 100 overvloedige CDR3-sequenties met de aangegeven lengte van meerdere patiënten met M.E./CVS relatief overéénstemmende AA-sequenties.

3.5. Plasmablast (PB) frequenties in het perifeer bloed van M.E./CVS-patiënten zijn gecorreleerd met ziekte-ernst

Om een idee te krijgen omtrent het mechanisme van de BCR-repertoire vertekening bij M.E./CVS, evalueerden we de distributie van B-cel subsets d.m.v. flow-cytometrie. We zagen een significant hoger percentage B-cellen in populaties van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van M.E./CVS-patiënten dan in deze van PBMCs van HCs (p = 0.0008). Daarnaast zagen we een verhoogde frequentie PBs (> 5,38%; gemiddelde + 2SD van HCs) bij 18% van de patiënten, hoewel de gemiddelde frequentie PBs niet significant verschillend was tussen HCs en M.E./CVS-patiënten. We keken dan naar de expressie van de B-cel oppervlakte-merker CD40, een co-stimulatie molekule die T-cellen aktiveert. De frequentie en het expressie-niveau van CD40+ PBs was significant gestegen bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. HCs. Interessant: de frequentie van PBs was significant gecorreleerd met de PS (ernst-score voor M.E./CVS (p = 0.01). Bovendien was de ziekteduur bij de meeste patiënten met verhoogde PBs minder dan 10 jaar, wat er op duidt dat de upregulering van PBs een hoofdkenmerk van ernstige, relatief vroegere fase M.E./CVS kan zijn.

3.6. Upregulering van interferon-induceerbare genen in PBs van M.E./CVS-patiënten

Om verder inzicht te verwerven omtrent de rol van PBs bij M.E./CVS-patiënten, analyseerden we de gen-expressie van PBs (600 RNA-molekulen). We zagen meerdere genen die ge-upreguleerd of gedownreguleerd waren bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs. Significant ge-upreguleerde genen waren MX1, IFI16 (type-I interferon [IFN]-induceerbare genen) & BCL2L11 (apoptose-gerelateerd 280 gen). RT-PCR analyse bevestigde dat de expressie-waarden van MX1 & IFI16, maar niet van BCL2L11, bij M.E./CVS significant hoger lagen dan bij HCs. In parallel met een gestegen frequentie van plasmablasten bij patiënten met relatief korte ziekteduur, was de expressie-waarde van IFI16 negatief gecorreleerd met ziekteduur […]. Verder was er een trend naar een negatieve correlatie tussen de expressie-waarde van MX1 en de ziekteduur […]. Daarnaast zagen we een significante toename van de expressie van MX1 bij patiënten met een diagnose van M.E./CVS na infektie-gerelateerde episodes vergeleken met deze zonder. Ten slotte vertoonde IFI16-expressie een positieve correlatie met IGHV3-30-3 frequentie bij M.E./CVS-patiënten maar niet bij HCs. Alles te samen zagen we een verband tussen de expressie van IFN-induceerbare genen in plasmablasten, specifiek IGHV gebruik en klinische parameters (relatief korte ziete-duur en infektie-gerelateerde episodes bij aanvang).

3.7. Expressie van IGH genen als potentiële diagnostische merker voor M.E./CVS

Om de reproduceerhaarheid van de bevindingen te evalueren, gebruikten we een nieuwe groep (Groep 2). De meeste van de ge-upreguleerde IGHs, uitgezonderd IGHV1-3 & IGHJ6, waren significant ge-upreguleerd vergeleken met de expressie-waarden van gezonde individuen, wat dus een bekrachtiging van de bevindingen in de originele groep is. We evalueerden de mogelijkheid dat verscheidene immuun-gerelateerde co-morbiditeit de scheeftrekking van het BCR-repertoire bij M.E./CVS kan beïnvloeden. We vergeleken de frequentie van IGHV1-3, 3-30, 3-30-3, 3-49, IGHD1-26 & IGHJ6 gebruik tussen gezonde controles en patiënten zonder immuun-gerelateerde co-morbiditeit van Groep 1 en Groep 2. We vonden significante upregulering van IGHV3-30, 3-30-3, 3-49 & IGHD1-26 bij de M.E./CVS-patiënten. Om te evalueren of de frequentie van of IGH-gebruik kan worden aangewend als een diagnostische merker voor M.E./CVS, voerden we een ‘receiver operating characteristic’ (ROC) curve analyse uit voor meerdere combinaties van merkers. Voor de expressie van IGHV1-3, 3-30, 3-30-3, 3-49, IGHD1-26 & IGHJ6, was de ‘area under the curve’ (AUC) van Groep 1 was 0,907, terwijl deze van Groep 2 0,846 was. Samengevat: BCR-repertoire analyse kan een bruikbare diagnostische merker bieden voor M.E./CVS-patiënten.

4. Bespreking

In deze studie analyseerden we de B-cel subset en het BCR-repertoire om ziekte-specifieke veranderingen te onthullen. De verbanden bij deze veranderingen leveren sterk bewijsmateriaal voor B-cel immune ontregeling bij de pathogenese van M.E./CVS.

Naar ons weten is dit het eerste onderzoek van het BCR-repertoire van perifere lymfocyten van M.E./CVS-patiënten […]. We stelden ‘skewing’ van het BCR-repertoire bij M.E./CVS-patiënten vast t.o.v dat bij gezonde individuen. Het is te zeggen: we toonden de upregulering van meerdere IGHV, IGHD & IGHJ genen in de B-cellen van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde individuen. Bovendien werd de scheeftrekking van het specifiek BCR-repertoire netjes gerepliceerd bij een tweede groep.

Van de zes IGH-genen met differentieel gebruik, waren de frequenties van IGHV 3-30 & IGHV 3-30-3 gebruik sterk gecorreleerd met elkaar en geassocieerd met een evidente infektie-gerelateerde episode bij aanvang, wat ongeveer de helft van onze groep omvatte. Daarom wordt de upregulering van deze IGHV verondersteld te worden geïnduceerd door infekties. [Niet noodzakelijk één specifieke infektie.] In feite werd gerapporteerd dat bij de meerderheid van de M.E./CVS-patiënten diverse infekties (inclusief verscheidene virussen en bakterieën) een trigger kunnen zijn.

De doelwit-antigenen van B-cellen die IGHV3-30/3-30-3 tot expressie brengen zijn onduidelijk. We toonden echter specifieke CDR3 lengte distributies met relatief geconserveerde AA-sequenties bij patiënten met verhoogde IGHV3-30/3-30-3 frequenties. Dit suggereert dat een vorm van antigene druk, waarschijnlijk verbonden met infektie-gerelateerde episodes, bij dergelijke patiënten speelde. Eerdere rapporten suggereerden dat IGHV3-30//3-30-3 genen gebruikt worden bij verscheidene infekties (waaronder malaria, influenza & covid-19). Omdat diverse infektueuze agentia enorm veel soorten antigenen omvatten, is het wellicht geen specifiek gemeenschappelijk antigeen motief afkomstig van pathogenen dat B-cel klonen met IGHV3-30 of 3-30-3 genen stimuleert. Verscheidene infekties kunnen een situatie triggeren waar een gemeenschappelijk motief (mogelijks van ‘self’ [lichaamseigen antigenen; die normaal gezien niet immunologisch worden aangevallen] of van commensale bakterieën) deze B-cel klonen induceert. Het kan waardevol zijn om na te gaan welke soort antigenen de B-cellen van patiënten met ge-upreguleerde IGHV3-30/3-30-3 beïnvloedt.

De vier differentiële IGH-genen (IGHV1-3, 3-49, IGHD1-26, IGHJ6) vertoonden geen verband met infektie-gerelateerde episode. Een scheefgetrokken BCR-repertoire treedt niet enkel op bij verscheidene infekties maar ook bij auto-immune ziekten. Daarom is het mogelijk dat gemeenschappelijke mechanismen kunnen leiden tot de vervorming van het BCR-repertoire bij M.E./CVS en auto-immune ziekten.

Er werd een verband aangetoond tussen IGHV3-23/30 en M.E./CVS gebruikmakend van een plasma-proteoom benadering [Milivojevic M et al. Plasma proteomic profiling suggests an association between antigen driven clonal B cell expansion and ME/CFS. PloS one (2020) 15: e0236148]. Ondanks verschillen qua methodologie, biedt het feit dat de expressie van het zelfde IGHV-gebied significant was verhoogd bij M.E./CVS-patiënten verder bewijsmateriaal voor het belang van IGHV3-30.

We vonden gestegen aantallen PBs in subsets patiënten met ernstige ziekte in een relatief vroege fase van de ziekte, hoewel de gemiddelde frequentie van PBs niet verschilde tussen HCs en M.E./CVS-patiënten. PBs zijn een subset antilichaam-producerende B-cellen waarvan is geweten dat ze expanderen na infektie, vaccinatie of de aanvang van auto-immune ziekten waarbij de produktie van auto-antilichamen is betrokken. In deze studie definieerden we PBs als CD19+CD27+CD180-CD38high. CD180 is een lid van de familie van molekulen rijk aan leucine [aminozuur] met homologie met de ‘Toll-like’ receptor 4 [‘toll-like’ receptoren = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen], die sterk tot expressie komt in naïeve en ‘memory’ B-cellen maar niet in plasmacellen. Er werd eerder gerapporteerd dat CD180- B-cellen geaktiveerde B-cellen zijn die in staat zijn auto-antilichamen aan te maken bij SLE. We hebben eerder getoond dat het aantal PBs gedefinieerd als CD19+CD27+CD180-CD38high die anti-aquaporine-4 auto-antilichamen produceren [aquaporinen = groep membraan-proteïnen (kanalen) die het transport van water vergemakkelijken], gestegen was in het perifeer bloed van patiënten met neuromyelitis optica [auto-immuunziekte waarbij het immuunsysteem de oogzenuw en het ruggenmerg aantast]. Meerdere groepen hebben gerapporteerd over de frequentie van B-cel subsets in patiënten met M.E./CVS. Deze studies definieerden PBs als CD19+CD38highIgMlow, CD19dimCD27highIgD-CD38high of CD19+IgD-CD38+++. Hoewel twee studies [Ramos S et al. & Mensah F et al., zie hierboven] niet op verschillen tussen M.E./CVS- en controle-individuen wezen, toonden Bradley AS et al. [zie hierboven] een significante daling van het aantal PBs in M.E./CVS-patiënten. Het lijkt aannemelijk dat de discrepanties bij deze studies, inclusief de huidige, te wijten zijn aan de verschillende instellingen [bij cel-sortering], antilichamen gebruikt voor de ‘kleuring’ en/of patiënten-selektie.

We hebben getoond dat de frequentie van B-cellen bij patiënten significant hoger is dan bij HCs. Andere studies [Bradley AS et al., Ramos S et al. & Mensah F et al., zie hierboven] vonden geen significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en controles. Klimas NG et al. rapporteerden echter dat B-cellen gestegen zijn in het perifeer bloed van patiënten. [Immunologic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Microbiology (1990) 28: 1403-1410] Deze discrepanties kunnen te wijten zijn aan andere patiënten-populaties en/of verschillende methodologie.

We evalueerden de expressie van immuun-gerelateerde genen in PBs van M.E./CVS-patiënten en vonden dat de IFN-induceerbare genen, MX1 & IFI16 ge-upreguleerd waren bij patiënten t.o.v. HCs. Er werd verstoorde B-cel differentiatie en overleving gerapporteerd in een studie die RNA-sequentiebepaling gebruikte om totaal-bloed van adolescente M.E./CVS-patiënten te analyseren [Nguyen CB et al., zie hierboven]. Deze studie detekteerde verhoogde expressie-waarden van IFI16 in het bloed van patiënten, wat consistent is met onze resultaten. De upregulering van IFN-induceerbare genen, de IFN-signatuur genaamd, is een hoofdkenmerk van virale infekties en Systemische Lupus Erythematosus, wat suggereert dat er sprake kan zijn van enige gemeenschappelijke immuun-gemedieerde pathologie bij minstens een subset M.E./CVS-patiënten.

Het stellen van de diagnose M.E./CVS vereist zorgvuldige evaluatie van een symptomen-constellatie en verscheidene ‘negatieve’ diagnostische testen voor differentiële diagnose, en bij M.E./CVS ontbreekt nog steeds een betrouwbare objectieve diagnostische merker. ROC-analyse van IGH gen-expressie uitgevoerd met twee groepen onthulde dat de AUC ca. 0,9 is: hoge sensitiviteit en specificiteit om M.E./CVS-patiënten te onderscheiden van HCs. Hoewel deze resultaten nog preliminair zijn, heeft deze methode het potentieel zich te ontwikkelen als een diagnostische biomerker.

Er zijn enkele beperkingen bij de huidige studie die geadresseerd dienen te worden. Ten eerste: deze studie werd uitgevoerd in één enkel centrum en het zou kunnen dat de deelnemende patiënten niet volledig representatief zijn voor typische M.E./CVS-patiënten. Om onze bevindingen beter te kunnen veralgemenen, is het nodig een internationale multi-centrum studie uit te voeren. We pakten de interviews echter zorgvuldig aan om de typische kern-symptomen van elke patient met M.E./CVS niet te missen (minstens twee klinici). Verder werden de B-cel subset analyses uitgevoerd door één researcher om de variabiliteit minimaal te houden. Ten tweede: onze resultaten konden beïnvloed geweest zijn door verscheidene immuun-gemedieerde ziekten die dikwijls bij M.E./CVS worden gevonden. Er was echter geen verschil qua BCR-repertoire tussen de patiënten met en zonder immuun-gerelateerde co-morbiditieiten (gegevens niet getoond). Bijkomend: de upregulering van IGHV3-30, 3-30-3, 3-49 & IGHD1-26 gebruik werd gezien bij patiënten zonder immuun-gerelateerde co-morbiditieit. Deze bevinding suggereert dat repertoire-‘skewing’ essentieel verband houdt met de pathogenese van M.E./CVS. Ten derde; bij dit relatief klein aantal stalen, konden we niet grondig evalueren hoe verscheidene symptomen van M.E./CVS verband houden met de scheeftrekking van het BCR-repertoire. Als we de substantiële heterogeniteit van M.E./CVS-symptomen en -karakteristieken in overweging nemen, moeten we de grootte van de groep bij toekomstige studies verhogen. Ten slotte: we namen geen ziekte-controle groep, zoals patiënten met depressie, op. Als een andere mogelijke HC-groep zouden personen met een voorafgaande infektie binnen een tijdskader gelijkaardig aan dat van de M.E./CVS-patiënten kunnen fungeren. Om BCR-repertoire analyse als een diagnostische merker te ontwikkelen, zouden we M.E./CVS met deze controle-groepen moeten vergelijken.

Tot besluit: we toonden dat specifiek BCR IGH gebruik selektief ge-upreguleerd is bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs. Bij de ge-upreguleerde genen zijn IGHV3-30/3-30-3 geassocieerd met een infektie-gerelateerde episode vóór de ziekte-aanvang, met relatief korte ziekteduur en met de expressie van type-1 IFN respons genen in PBs. BCR-repertoire analyse zou een krachtig instrument kunnen zijn om te helpen bij de diagnose van M.E./CVS. Het zou ook gebruikt kunnen worden om de doeltreffendheid van op B-cellen gerichte therapie, die kan werken voor een subgroep patiënten, te voorspellen.