Researchers van de Universiteit van Montréal o.l.v. Prof. dr Alain Moreau (directeur van het ‘Molecular Genetics Laboratory of Musculoskeletal Diseases’) rapporteren over een potentiële diagnostische test die kan worden toegepast bij M.E.(cvs)-patiënten die anders niet kunnen deelnemen aan klinische studies (omwille van de ernst van hun symptomen). Het opwekken van post-exertionele malaise na inspanning gebeurde hier niet d.m.v. de courante fiets-test maar via mechanische stimulatie (90 minuten, al zittend) aan de arm (met een opblaasbaar manchet). De zachte pulserende compressies zouden een milde PEM genereren (blijkend uit de symptomen die de patiënten rapporteren bij bevraging).
Meting van microRNAs (lees onze eerdere stukken omtrent miRNA) in het bloed, voor en na ‘inspanning’ gaf bij een aantal daarvan veranderingen (af- of toename) aan. Men ontdekte 11 miRNAs die geassocieerd zijn met M.E.(cvs) en de ‘differentiële miRNA-signaturen’ konden patiënten in 4 groepen onderverdelen. Dit zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van een nieuwe diagnostische test. In een interview stelde Moreau: “Er kregen geen gezonde controles verkeerdelijk de diagnose van M.E.(vs), noch werd, omgekeerd, een M.E.(cvs)-patient als gezond bestempeld.”.
De resultaten dienen te worden gevalideerd bij andere populaties om na te gaan of de biomerkers sensitief genoeg zijn voor de detektie van M.E.(cvs). Men hoopt dat een precieze molekulaire signatuur het mogelijk maakt patiënten te onderscheiden van gezonde individuen en van mensen met fibromyalgie. Frances Williams (‘King’s College London’) betwijfelt dat enkel het meten van microRNAs alleen zou volstaan om de diagnose van M.E.(cvs) te stellen (omwille van de genetische en epigenetische complexiteit van de ziekte) maar in combinatie met andere zaken, zou het wel nuttig kunnen zijn. Volgens Mady Hornig (‘Columbia University Mailman School of Public Health’) is de sterkte dat de technologie (meten van vrij circulerende sequenties in het bloed en dus geen extraktie uit cellen nodig) redelijk eenvoudig is en dus geschikt voor een klinische setting. Ze loofde ook het gebruik van de PEM-inducerende stressor, die respect toont voor de moeilijkheden van de ernstig aangetaste patiënten.
Verder willen we nog opmerken dat er door onderzoekers werd aangekaart dat vasten een invloed kan hebben op de differentiële expressie van miRNAs en het is bekend dat dieet de ontwikkeling van chronische ziekte beïnvloedt. Inconsistenties wat betreft miRNA expressie-profielen kunnen dus, minstens gedeeltelijk, daarvan het resultaat zijn. Ook iets om rekening mee te houden…
————————-
Scientific Reports Vol 10, Article number: 19620 (2020)
Profile of circulating microRNAs in Myalgic Encephalomyelitis and their relation to symptom severity and disease pathophysiology
Evguenia Nepotchatykh (1,2), Wesam Elremaly (1,3), Iurie Caraus (1,3), Christian Godbout (4), Corinne Leveau (1,3), Lynda Chalder (1,3), Catherine Beaudin (1), Emi Kanamaru (1), Renata Kosovskaia (1), Shawn Lauzon (1), Yanick Maillet (1), Anita Franco (1), Viorica Lascau-Coman (1), Saadallah Bouhanik (1), Yaned Patricia Gaitan (1), Dawei Li (5), Alain Moreau (1,2,3,6)
1 Viscogliosi Laboratory in Molecular Genetics of Musculoskeletal Diseases, Sainte-Justine University Hospital Research Cenre, Montreal, Canada
2 Molecular Biology PhD Program, Faculty of Graduate and Postdoctoral Studies, Universite de Montreal, Canada
3 Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Universite de Montreal, 2900, Canada
4 Patient-Partner, ICanCME Research Network, Sainte-Justine University Hospital Research Centre, Montreal, Canada
5 Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Vermont, USA
6 Department of Stomatology, Faculty of Dentistry, Universite de Montreal, Canada
Samenvatting
Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe chronische ziekte, met multi-systemische dysfunkties die worden gekenmerkt door onverklaarde uitputtende vermoeidheid. Post-exertionele malaise (PEM), gedefinieerd als de verergering van de symptomen van de patient na minimale lichamelijke of mentale belasting, is een hoofd-kenmerk van M.E./CVS. Hoewel er meerdere definities bestaan, zijn er momenteel geen biomerkers of laboratorium-testen voor de diagnose van M.E./CVS. Onze studie had als doel de expressie van circulerende microRNAs te onderzoeken bij ernstig zieke M.E./CVS-patiënten vóór en na een innovatieve belasting die PEM stimuleert. Onze bevindingen beklemtonen de differentiële expressie van 11 microRNAs die geassocieerd zijn met een fysiologische respons op PEM. De huidige studie ontbloot specifieke microRNA-expressie signaturen verbonden met M.E./CVS in respons op PEM-inductie en meldt microRNA-expression patronen geassocieerd met specifieke symptoom-ernsten. De identificatie van onderscheidende microRNA-expressie signaturen voor M.E./CVS via een uitlokkende belasting is essentieel voor de opheldering van de pathofysiologie van M.E./CVS en leidt tot accurate diagnoses, preventie-maatregelen en doeltreffende behandel-opties.
Inleiding
[…] Er zijn momenteel geen gevalideerde diagnostische biomerkers voor M.E./CVS. Artsen moeten de diagnose stellen via een klinische beoordeling om andere ziekten met gelijkaardige symptomen uit te sluiten. Daarom is de ontdekking van specifieke biologische biomerkers essentieel om accurate diagnoses, een beter begrip van de M.E./CVS-pathofysiologie en doelgerichte behandelingen te bekomen.
MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van kleine niet-coderende RNAs die gen-expressie reguleren op post-translationeel en/of post-transcriptioneel niveau gericht op mRNAs. [transcriptie: DNA => RNA; translatie: RNA => proteïne] MiRNAs hebben verscheidene rollen bij verschillende biologische processen, zoals het metabolisme, cel-overleving en -differentiatie. De ontregeling van de expressie van miRNAs is betrokken bij veel ziekten, inclusief kanker-progressie en neurodegeneratieve ziekten. Eerdere studies onthulden dat differentieel tot expressie komende miRNAs geassocieerd waren met M.E./CVS [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One (2014) 9: e102783 /// Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J. Affect Disord. (2012) 141: 261-269 /// Petty RD, Kerr JR et al. MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: potential diagnostic biomarkers in natural killer (NK) cells of patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One. (2016) 11: e0150904]. De detektie van miRNA-signaturen die indicatief zijn voor de molekulaire mechanismen die aan de basis liggen van specifieke M.E./CVS kern-symptomen kunnen biologische inzichten verstrekken voor het differentiëren van ernstige gevallen van milde vormen van M.E./CVS, waarbij sleutels worden aangereikt omtrent de ontwikkeling van M.E./CVS en z’n pathofysiologie. In de huidige studie voerden we een uitgebreide profilering uit van circulerende miRNAs op plasma-stalen van patiënten met ernstige M.E./CVS (aan huis gebonden), bij ‘baseline’ en in respons op de toepassing van een belasting die post-exertionele malaise veroorzaakt. Dit uniek experimenteel ontwerp liet ons toe afzonderlijke molekulaire voetafdrukken van M.E./CVS te bepalen via het vergelijken van de differentiële expressie van miRNA in het plasma vóór en na 90 min stimulatie, die PEM induceerde, met voor leeftijd en geslacht gematchte controles. Via de implementatie van een ‘machine-learning’ [het ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten ‘gedragingen’ te ontwikkelen/voorspellingen te maken op basis van empirische gegevens] algoritme (‘Random Forest’), valideerden we 11 microRNAs (hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-374b-5p, hsamiR-486-5p, hsa-miR-3620-3p, hsa-miR-4433a-5p & hsa-miR-6819-3p), het eerste diagnostische panel van z’n soort. Differentiële expressie van deze 11 circulerende miRNAs leidde tot de identificatie van 4 M.E./CVS-clusters met afzonderlijke miRNA-profielen en specifieke symptoom-ernsten.
Resultaten
Klinische en demografische karakteristieken van de deelnemers
Er werden twee bloedstalen afgenomen van elke deelnemer: één bij ‘baseline’ en na 90 min stimulatie via het toepassen van een post-exertionele belasting. Voor de ‘ontdekking’-groep werden 38 plasma-stalen afgenomen van 11 M.E./CVS-patiënten (9 vrouwen & 2 mannen) en 8 gematchte gezonde controles (5 vrouwen & 3 mannen). Voor de ‘replicatie’-groepen, werden 98 plasma-stalen verkregen van 32 M.E./CVS-patiënten (18 vrouwen & 14 mannen) en 17 gematchte controles (11 vrouwen & 6 mannen). Voor beide groepen werden er geen significante verschillen qua leeftijd, geslacht en body-mass-index (BMI) vastgesteld tussen M.E./CVS-patiënten en gematchte controles. Er was geen significant verschil qua ziekte-duur tussen beide M.E./CVS-groepen. Alle deelnemers vulden drie zelf-rapportering vragenlijsten in: de ‘Short Form 36-Item Health Survey’ (SF-36), de ‘Multidimensional Fatigue Inventory-20’ (MFI-20) en de ‘DePaul Symptom Questionnaire’ (DSQ). Zoals verwacht werden significante verschillen voor alle gezondheid-scores gezien tussen de M.E./CVS-groepen en gematchte gezonde controles.
Ontwikkeling van een gestandardiseerde post‑exertionele stress belasting
PEM is een hoofdkenmerkend symptoom dat M.E./CVS differentieert van andere gerelateerde aandoeningen. Om PEM veilig op te wekken bij deelnemers met M.E./CVS, introduceerden we een post-exertionele stress belasting gebruikmakend van een therapeutische stimulator. Er werden van elke deelnemer bloedstalen genomen bij ‘baseline’ (vóór stimulatie) en na 90 min stimulatie om de veranderingen in de miRNA-expressie profielen in respons op deze mechanische stimulatie te evalueren. Alle deelnemers werden zeven dagen nadien geïnterviewd om na te gaan of onze post-exertionele stress belasting symptomen geassocieerd met PEM induceerde of verergerde, gezien het feit dat de ontwikkeling van PEM zeer variabel is van individu tot individu. Alle M.E./CVS-individuen rapporteerden PEM-symptomen, terwijl geen enkele werden gemeld door de controles. Diepgaande vermoeidheid, hoofdpijn, spierpijn, slaapstoornissen en griep-achtige symptomen waren de meest frequent gerapporteerde symptomen na de belasting. Deze innovatieve methode biedt meerdere voordelen t.o.v. de klassieke benaderingen die circulerende miRNAs enkel bij ‘baseline’ meten zonder enige belasting. Ten eerste: deze methode laat toe elke deelnemer haar/zijn eigen experimentele controle te zijn gezien het feit dat wijzigingen in de profielen van circulerende miRNAs (of om ‘t even welke andere biomerkers) in respons op post-exertionele stress veroorzakende belasting meer waarschijnlijk ziekte-specifieke merkers onthullen, en reduceren de storende invloed van andere factoren zoals ingenomen medicatie, ziekte-duur, leeftijd, geslacht en zelfs de aanwezigheid van bepaalde co-morbide aandoeningen. Ten tweede: onze methode heeft de verdienste van draagbaar en kosten-effeciciënt te zijn. Het kan het testen toelaten van ernstig zieke individuen met M.E./CVS (bv. aan huis gebonden) die zelden deelnemen aan klinische studies. Ten slotte: de korte stimulatie-periode (slechts 90 min) laat snellere en meer direct meting toe van onmiddellijke molekulaire veranderingen die optreden in respons op PEM, wat contrasteert met andere benaderingen waarbij een inspanning-belasting over een periode van één of twee dagen nodig is. [Cheema AK, Klimas NG et al. Unravelling Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): Gender-specific changes in the microRNA expression profiling in ME/CFS. J. Cell Mol. Med. (2020) 24: 5865-5877 /// Takakura S et al. Changes in circulating microRNA after recumbent isometric yoga practice by patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: an explorative pilot study. BioPsychoSocial Med. (2019) 13: 29 /// Baraniuk JN & Shivapurkar N. Exercise-induced changes in cerebrospinal fluid miRNAs in gulf war illness, Chronic Fatigue Syndrome and sedentary control subjects. Sci. Rep. (2017) 7: 15338]
Identificatie van individuele miRNAs geassocieerd met M.E./CVS en PEM
Voor de identificatie van kandidaat circulerende miRNAs met differentiële expressie bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles – ‘baseline’ versus post-exertionele stress belasting – werden bij de ‘ontdekking’-groep de humane miRNA expressie 8 × 60 K ‘chips’ van Agilent aangewend. Er werden 17 miRNAs geïdentificeerd met differentiële expressie […]. We vonden dat de expressie bij ‘baseline’ van hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-181b-5p was verhoogd (hoogste ‘fold-change’ [“mate van verandering”; maatstaf voor het beschrijven hoeveel een hoeveelheid/grootheid verandert (oorspronkelijke vs. volgende meting)] (FC) = +2,86; P < 0.05] en deze van hsa-miR-4433a-5p & hsa-miR-6819-3p gedaald (-6,46 FC; P < 0.001 & -11.13 FC; P < 0.001 respectievelijk) in de M.E./CVS-groep vergeleken met gezonde controles. Na 90 min stimulatie stegen de expressie-waarden van hsa-miR-127-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-5581-5p, hsa-miR-6076, hsa-miR-6717-5p, hsa-miR-6875-5p en deze van hsa-miR-486-5p, hsa-miR-3620-3p & hsa-miR-6507-3p verminderden in de M.E./CVS-groep t.o.v. controles. Bovendien onthulde een vergelijking van miRNA-expressie waarden bij ‘baseline’ versus stimulatie in de M.E./CVS-groep bijkomende veranderingen met significante stijging van de expressie of hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-140-5p & hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-6875-5p en daling van de expressie van hsa-miR-486-5p & hsa-miR-6800-3p. Een gelijkaardige vergelijking in de controle-groep onthulde een verhoogde expressie van hsa-miR-3620-3p & hsa-miR-6507-3p.
Onafhankelijke validatie- en replicatie-testen van de geïdentificeerde miRNAs
De expressie-waarden van de 17 circulerende miRNAs die werden geïdentificeerd in onze ‘ontdekking’-groep werden gevalideerd d.m.v. kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) in een onafhankelijke ‘replicatie’-groep en de ‘fold-difference’ [maat die beschrijft hoeveel een meting verandert] gekwantificeerd. We repliceerden succesvol 11 van de 17 geïdentificeerde miRNAs. Van 6 miRNAs (hsa-miR-5581-5p, hsa-miR-6076, hsa-miR-6717-5p, hsa-miR-6875-5p, hsa-miR-6800-3p & hsa-miR-6507-3p) waren we niet in staat de expressie-waarden te detekteren omdat het qPCR-signaal te laag was om een goede, reproduceerbare kwantificatie te verkrijgen. Bij de gerepliceerde 11 miRNAs bleken de expressie-waarden van hsa-miR-28-5p, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR4433a-5p & hsa-miR-6819-3p significant hoger bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de gezonde controle-groep bij ‘baseline’ (P < 0.05). De expressie-waarden van hsa-miR-150-5p, hsa-miR-486-5p & hsa-miR-3620-3p waren significant hoger bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de gezonde controle-groep na 90 min stimulatie (P < 0.05). Van belang is dat er geen significante verschillen werden gezien wat betreft de verandering qua expressie van deze 11 miRNAs tussen vrouwen en mannen; niet bij M.E./CVS noch bij de controles.
Met M.E./CVS geassocieerde miRNAs en symptoom-ernst
Na de validatie-stap, evalueerden we of deze 11 circulerende miRNAs voldoende waren voor de diagnose van M.E./CVS en of hun differentiële expressie profielen geassocieerd waren met typische M.E./CVS-symptomen en/of symptoom-ernst via het ‘Random Forest Model’ (RFM) [zie ‘Materialen en methodes’]. We pasten het RFM toe op ΔCT-gegevens afgeleid van RT-qPCR (enkel corresponderend met de ‘baseline’ miRNA-expressie waarden) verkregen uit de ‘training’-gegevens, corresponderend met 80% van onze patiënten-groep, en RT-qPCR ΔΔCT-gegevens (corresponderend met differentiële miRNA-expressie waarden na stimulatie versus ‘baseline’ expressie-waarden) gebruikmakend van dezelfde ‘training’-gegevens. De resultaten duiden op een excellente prestatie van ons RFM met de ΔΔCT gebruikmakend van een ‘test’ gegevensset corresponderend met 20% van onze patiënten-groep (ongeteste M.E./CVS-gevallen). We verkregen een nauwkeurigheid van 90%, een sensitiviteit van 100%, een specificiteit van 75% en precisie van 86%, met een ROC-curve AUC = 1. Deze resultaten contrasteerden significant met deze wanneer het RFM werd toegepast op de ΔCT-gegevens bij ‘baseline’ alleen. We pasten dan de ‘K-means’ methode [statistische berekening] toe op de combinatie van de veranderingen qua expressie-niveau van de 11 miRNAs, wat leidde tot een onpartijdige automatische klassificatie van M.E./CVS-patiënten in 4 afzonderlijke clusters. Er werd een significant verschil van de ΔΔCT-waarden voor elk van de 11 miRNAs tussen de 4 clusters bekomen (P < 0.05). We zagen een duidelijk miRNA-profiel in elk van de 4 clusters. In cluster 1 waren alle miRNAs gedownreguleerd uitgezonderd hsa-miR-150-5p & hsa-miR-181b-5p, die beide ge-upreguleerd waren. In cluster 2 waren 6 miRNAs ge-upreguleerd en 5 miRNAs gedownreguleerd. In cluster 3 waren alle 11 miRNAs ge-upreguleerd, terwijl in cluster 4 ze allemaal gedownreguleerd waren. Dan voerden we een analyse uit van de verschillen qua M.E./CVS kern-symptomen in de 4 clusters (op basis van de zelf-rapportering vragenlijsten SF-36, MFI-20 & DSQ). We zagen dat M.E./CVS-patiënten in cluster 2 & 3 ernstiger symptomen hadden vergeleken met de individuen in clusters 1 & 4. In het bijzonder: M.E./CVS-patiënten in cluster 2 vertoonden slechtere scores voor algemene vermoeidheid (MFI-20 vragenlijst), ernstigste PEM en ernstige slaapstoornissen scores (DSQ vragenlijst) aangaven. Deze aan huis gebonden patiënten rapporteerden ook een significant verminderde dagelijkse aktiviteit: slechts 2,9 ± 1,2 h (P < 0.05), vergeleken met de M.E./CVS-patiënten in de andere drie clusters. Van belang is dat de M.E./CVS-patiënten in cluster 2 een groter aantal co-morbiditeiten vertoonden t.o.v. de andere clusters. Ondanks het feit dat de M.E./CVS-patiënten in cluster 1 & 4 milder symptomen hadden, vertoonden deze in cluster 4 de slechtste score qua mentale vermoeidheid (MFI-20 vragenlijst) in vergelijking met de andere clusters. Wanneer we de klinische en demografische gegevens van de deelnemers bekeken wat betreft leeftijd, BMI, geslacht en ziekte-duur leverde dit geen significante verschillen op tussen de 4 clusters.
Gen-paden en -netwerken
M.E./CVS is een multi-systeem ziekte waarbij het immuunsysteem, de energie-produktie en het brein betrokken zijn. Om de mechanistische rollen van de door ons geïdentificeerde miRNAs bij de molekulaire funkties en fysiologische symptomen van M.E./CVS beter te begrijpen, voerden we systematische genen-paden en -netwerk analyses uit. Aangezien M.E./CVS onvoldoende bestudeerd werd wat betreft genetica en epigenetica, is de kennis over M.E./CVS-gerelateerde genen-netwerken beperkt. Niettemin toonde onze analyses van gen-mechanismen m.b.v. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ (IPA) software [om expressie-profielen te analyseren om overheersende mechanismen en het betrokken interaktie-netwerk te bepalen] dat 7 van de 11 miRNAs betrokken waren bij immuun-responsen of inflammatie, en één was betrokken bij het musculair systeem. We pasten dan een hybride benadering toe van IPA en manuele verwerking. We zochten eerst in de literatuur en identificeerden manueel genen, alsook molekulaire en fysiologische funkties waarover werd gerapporteerd dat ze geassocieerd zijn met M.E./CVS, en bouwden dan connecties op met elk van de 11 miRNAs op basis van de experimenteel geobserveerde ‘Ingenuity Knowledge Base’ [database met biologische en chemische interakties/funkties]. Deze uitgebreide analyse liet ons toe completere netwerken te construeren die elke miRNA verbond met z’n doelwitten (bv. M.E./CVS-gerelateerde genen en fysiologische funkties) die cruciale rollen kunnen spelen bij de pathogenese van M.E./CVS. Zoals verwacht onthulden onze opgebouwde netwerken meerdere sleutel-symptomen en kenmerken van M.E./CVS. Gebruikmakend van IPA en manuele behandeling, construeerden we verder een groter en meer compleet netwerk dat al deze (11) miRNAs verbond met hun belangrijkste genen, funkties en ziekte-doelwitten.
Bespreking
M.E./CVS blijft wereldwijd significante morbiditeit veroorzaken en er wordt geschat dat 84-91% van de personen met M.E./CVS-symptomen geen diagnose krijgt omwille van het gebrek aan diagnostische biomerkers. Gebruikmakend van een twee-staps strategie, onderzochten we de expressie-waarden van miRNAs in het plasma van alle deelnemers (patiënten met ernstige M.E./CVS en gematchte gezonde controles) bij ‘baseline’ (T0) en na toepassing van een gestandardiseerde post-exertionele stress belasting (T90). We kwantificeerden de veranderingen qua miRNA-waarden d.m.v. de ΔΔCT-methode [zie ‘Materialen en methodes’]. Onze analyse identificeerde 11 miRNAs geassocieerd met M.E./CVS in respons op een belasting die post-exertionele stress veroorzaakt. We brachten een ‘Random Forest Model’ tot stand op basis van miRNA-expressie veranderingen (ΔΔCT) vóór en na de belasting. Dit uniek experimenteel ontwerp liet met hoge nauwkeurigheid (90%) de identificatie toe van M.E./CVS-patiënten versus gezonde controles, wat dan uiteindelijk kan worden gebruikt om te voorspellen of individuen hebben. We toonden dat het biologisch geslacht de miRNA-expressie niet beïnvloedt, niet bij ‘baseline’ en niet in respons op de inductie van PEM. Onze resultaten staan in scherp contrast met eerder werk van Cheema AK et al. [zie hierboven] dat toonde dat mannen en vrouwen met M.E./CVS verschillende miRNA-expressie profielen vertonen in respons op inspanning. Deze tegenstrijdige bevindingen zouden voornamelijk verklaard kunnen worden door het gebruik van andere experimentele ontwerpen, het gebruik van PBMCs vs. plasma, alsook door de klinische heterogeniteit van de geteste M.E./CVS-gevallen (matig vs. ernstig). Het gebruik van de ‘K-means’ methode liet ons M.E./CVS-patiënten te categoriseren in 4 clusters, volgens hun miRNA-expressie profielen en corresponderend met verschillende ernst van hun symptomen. Inderdaad: de M.E./CVS-patiënten in clusters 2 & 3 hadden de ernstigste symptomen een de meeste van hun miRNAs waren ge-upreguleerd. Omgekeerd hadden de M.E./CVS-patiënten in clusters 1 & 4 matige symptomen en hun miRNAs waren gedownreguleerd.
De meerderheid van de geïdentificeerde circulerende miRNAs in onze groep zijn betrokken bij de regulering van de immuniteit. De meeste zijn nieuw en worden voor de eerste keer geassocieerd met M.E./CVS (hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-3620-3p, hsa-miR-4433a-5p, hsa-miR-6819-3p), terwijl enkele andere eerder werden gerapporteerd bij andere M.E./CVS-groepen (hsa-miR-127-3p, hsa-miR-140-5p & hsa-miR-150-5p) en ook voor het eerst gerepliceerd in onze studie. Inderdaad: hsa-miR-127-3p werd eerder gerapporteerd in een Australische M.E./CVS-groep [zie Brenu EW et al. (2014) hierboven]. Dit miRNA reguleert de expressie van het BCL6 gen, dat codeert voor een transcriptie-factor genaamd B-cel lymfoma 6 proteïne en dat de expressie van of interleukine-10 (IL-10) inhibeert. Dit anti-inflammatoir cytokine speelt een centrale rol bij het beperken van immuun-responsen van de gastheer tegen pathogenen. Er werd aangetoond dat IL-10 gestegen is in het cerebrospinaal vocht van enkele patiënten met M.E./CVS [Natelson BH et al. Spinal fluid abnormalities in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2005) 12: 52-55]. Werk door Almenar-Pérez E et al. heeft een upregulering van hsa-miR-140-5p expressie getoond in PBMCs van M.E./CVS-patiënten [Assessing diagnostic value of microRNAs from peripheral blood mononuclear cells and extracellular vesicles in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Sci. Rep. (2020) 10]. Dit miRNA reguleert de differentiatie van T-cellen en beïnvloedt CD4+ T-cel metabolisme. Bovendien kan over-expressie van hsa-miR-140-5p bij sommige M.E./CVS-patiënten leiden tot een significant toename van het UL16 proteïne. Dit glycoproteïne (gecodeerd door het ULBP1 gen) is verantwoordelijk voor de aktivatie van ‘natural killer’ (NK) cellen en T-lymfocyten […]. Cheema AK et al. [zie hierboven] rapporteerden over de upregulering of hsa-miR-150-5p in PBMCs van M.E./CVS-patiënten in respons op inspanning. Dit miRNA staat er om bekend geassocieerd te zijn met de modulatie van immuniteit en inflammatoire respons, terwijl wordt voorspeld dat dit miRNA veel genen te reguleren die deelnemen in de proliferatie van immuuncellen.
Bij de nieuwe circulerende miRNAs met verschillende expressie in de huidige studie zijn hsa-miR-28-5p & hsamiR-29a-3p significant geassocieerd met CD4+ T-cel aantallen. Interessant: er wordt voorspeld dat hsa-miR-28-5p zich richt op de genen […] die gekend zijn voor hun deelname in de immuuncel-responsen en hun differentiatie stimuleren. Zo wordt ook voorspeld dat hsamiR-29a-3p is zicht richt op genen zoals ADA (adenosine-deaminase), ITGB1 (integrine subunit-beta-1) & STAT3 (‘signal transducer and activator of transcription 3’), die betrokken zijn bij veel cellulaire funkties, inclusief de dood van immuuncellen. Er dient te worden opgemerkt dat over-expressie van hsa-miR-29a-3p in M.E./CVS-patiënten kan bijdragen tot hun verminderd vermogen om te reageren op bepaalde virale infekties […]. […] De expressie van hsa-miR-181b-5p is gedaald in invariant NK T-cel [iNKT; invariante of type-1 NK T-cellen; dragen een invariante T-cel receptor (TCR)] deficiënte muizen en het is interessant dat ernstig zieke M.E./CVS-patiënten ook wijzigingen van hun invariant NK T-cellen vertoonden [Hardcastle SL et al. Longitudinal analysis of immune abnormalities in varying severities of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients. J. Transl. Med. (2015) 13 /// Ramos S, Brenu E et al. Regulatory T-, natural killer T- and γδ T-cells in Multiple Sclerosis and Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a comparison. Asian Pac. J. Allergy Immunol. (2016) 34: 300-5]. Gewijzigde expressie van hsa-miR-4433a-5p werd eerder gerapporteerd in serumstalen van patiënten geïnfekteerd met influenza-H7N9. Aangezien veel M.E./CVS-patiënten meldden dat hun ziekte-aanvang volgde op een virale infektie, is dit miRNA van belang gezien het feit dat z’n voorspelde doelwitten betrokken zijn bij de regulering van virale responsen. Hsa-miR-6819-3p is een ander miRNA waarvan wordt voorspeld dat het deelneemt in de abnormale immuun-responsen en PEM bij M.E./CVS. Het is het vermelden waard dat dit miRNA zich ook richt op genen die eerder gerelateerd werden aan M.E./CVS: KLF3 (‘Krüppel-like factor 3’) [hoge expressie in rode bloedcellen; onderdrukt transcriptie] & TLR3 (‘Toll-like receptor 3’) [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]. […]
Circulerende miRNAs zijn ook gewijzigd na inspanning en kunnen betekenis hebben als nuttige biomerkers voor de karakterisatie van PEM bij M.E./CVS en als therapeutische doelwitten ter voorkoming of management van deze aandoening. Omtrent de miRNAs die geassocieerd zijn met de fysiologische responsen op inspanning suggereerde Een groep Russische onderzoekers vonden dat hsa-miR-181b-5p meerdere rollen kan spelen bij de aanpassing aan lichamelijke inspanningen als een regulator van de uithouding. Amerikaanse researchers hebben een over-expressie van hsa-miR-181b-5p gerapporteerd in het plasma na inspanning. Inderdaad: blootstelling van muizen aan acute inspanningen resulteerde in een significante toename qua mmu-miR-181b-5p expressie in skeletspier-weefsel van jonge (maar niet oudere) muizen. Eerder werk onthulde een sterke rol voor hsa-miR-181b-5p bij vasculaire inflammatie bij obesitas, insuline-resistentie, sepsis en cardiovasculaire ziekte. Daarom suggereren deze resultaten dat hsa-miR-181b-5p een rol kan spelen bij het dempen van inflammatie in respons op acute inspanning. Op dezelfde manier was de expressie van hsa-miR-486-5p in respons op regelmatige inspanning significant verhoogd bij sedentaire oudere mannen, in tegenstelling tot gezonde volwassenen die eerdere een daling qua hsa-miR-486-5p expressie vertoonden. Van belang: acute inspanning genereert een significante stijging van de hsa-miR-486-5p expressie bij jonge mannen. Interessant is dat upregulering van hsa-miR-486-5p expressie bij uithouding-atleten positief correleert met VO2max-waarden. Onder de andere miRNAs die geassocieer zijn met inspanning, is hsa-miR-3620-3p deze met de meeste over-expressie bij uithouding-atleten en z’n expressie is gestegen bij M.E./CVS-patiënten, terwijl ze gedaald is bij controle-individuen na de toepassing van onze post-exertionele stress. Dit miRNA richt zich op genen betrokken bij de regulering van de circadiaanse klok, zoals PER 2 (‘period circadian protein homolog 2’) & PER3 (‘period circadian protein homolog 3’), en zouden kunnen betrokken zijn bij slaap-stoornissen die voorkomen bij M.E./CVS-patiënten.
In de huidige studie tonen we hogere expressie van hsa-miR-374b-5p in het plasma bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles bij ‘baseline’, wat in tegenstelling is met de bevindingen van een eerdere studie die het tegengestelde toonde maar wat kan worden verklaard door het gebruik van PBMCs i.p.v. plasma [zie Cheema AK et al. hierboven]. Hsa-miR-374b-5p is gericht op veel genen waarvan wordt voorspeld dat ze betrokken zijn bij veel M.E./CVS-symptomen, inclusief mitochondriale dysfunkties, tarwe-sensitiviteit, vermoeidheid en vitamine-E metabolisme. Bovendien kunnen hoge hsa-miR-374b-5p expressie-waarden bij ‘baseline’ of na PEM-inductie een essentiële rol bij de regulering van de vorm en membraan-vervormbaarheid van rode bloedcellen (RBCs) spelen […]. Dit is van belang gezien het feit dat RBCs van M.E./CVS-patiënten significant groter zijn en minder vervormbaar dan deze van gezonde individuen [Saha AK, Davis RW et al. Red blood cell deformability is diminished in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Hemorheol. Microcirc. (2019) 71: 113-116].
Wat betreft mogelijke beperkingen: er dienen longitudinale studies te worden ondernomen om de variabiliteit van de ontwikkeling van PEM, symptoom-ernst en duur na de toepassing van onze post-exertionale stress inductie te karakteriseren. Hoewel ernstig aangetaste personen met M.E./CVS (huisgebonden of bedlegerig) niet kunnen worden getest d.m.v. CPET [cardiopulmonaire inspanning test], zou het interessant zijn milde en matige aangetaste patiënten via beide methodes, met een panel van circulerende microRNAs, te vergelijken om hun sensitiviteit en beperkingen vast te stellen.
Tot besluit: we ontwikkelden een post-exertionele stress belasting die PEM bij M.E./CVS-patiënten uitlokt. Meting van de differentiële expressie van circulerende miRNAs bij ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten leidde tot de ontdekking en validatie van 11 miRNAs die geassocieerd zijn met M.E./CVS. Op basis van deze verschillende miRNA-signaturen, leidde ‘machine-learning’ tot de klassificatie van M.E./CVS-patiënten in 4 clusters geassocieerd met symptoom-ernst. Deze bevindingen kunnen het fundament vormen voor de ontwikkeling van een nieuwe niet-invasieve test voor de diagnose van M.E./CVS-patiënten. Deze miRNA-signaturen en -clusters kunnen uiteindelijk gebruikt worden om reakties op farmacologische behandelingen voor M.E./CVS te voorspellen, en zelfs klinici toelaten individuen te identificeren die baat hebben bij dergelijke behandelingen. Daarnaast stellen we mogelijke mechanismen voor (die zullen moeten worden gevalideerd) waarmee elk van de miRNAs een rol kunnen spelen in de pathogenese en etiologie van M.E./CVS.
Materialen en methodes
Studie-populaties
Er werden voor deze studie 43 patiënten met M.E./CVS en 25 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles gerecruteerd. De M.E./CVS-patiënten kregen de diagnose gebruikmakend van de Canadese consensus criteria. […]
Evaluatie van M.E./CVS-symptomen en gezondheidstoestand van de deelnemers
Standaard vragenlijsten: ‘36-Item Short-Form Health Survey’ (SF-36), ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ (MFI-20) en de ‘DePaul Symptom Questionnaire’ (DSQ) […]. SF-36 geeft een score voor de lichamelijke en mentale gezondheid. MFI-20 scores geven een opdeling qua algemene vermoeidheid, lichamelijke vermoeidheid, verminderde aktiviteit, gedaalde motivatie en mentale vermoeidheid. De DSQ (54 opgetelde waarden om de gezondheidstoestand te beoordelen) gegroepeerd in 4 factoren: neuro-endocriene, autonomie & immune dysfunktie; cognitive dysfunktie; post-exertionele malaise en slaapstoornissen.
Post‑exertionele stress belasting
De deelnemers werden blootgesteld aan een stress-test om PEM uit te lokken, gebruikmakend van een ABR [Advanced Biomechanical Rehabilitation] therapeutische stimulator [origineel bedoeld om spierpijn te verlichten] ontwikkeld door Panacis Medical (Ottawa, Ontario, Canada). De ABR methode omvat een oplaasbaar manchet dat wordt aangebracht aan de arm. Het manchet geeft dynamisch pulserende compressies die een druk met variabele amplitude van 0-4 psi bij 0,006 Hz uitoefenen. Alle deelnemers kregen de mechanische stimulatie gedurende 90 min (T90) […]. [Er wordt in het artikel niet uitgelegd hoe dit toestel precies aanleiding heeft tot PEM.]
Afname van bloedstalen
[…]
RNA-extractie voor microRNA-chip analyse
[…]
Microchip-analyse
[…] Agilent expressie ‘array’ – Human miRNA 8 × 60 K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) met 2.549 menselijke miRNAs. We selekteerden enkel miRNAs met een ± tweevoudige verandering met een ‘false discovery rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]) < 0.005 […].
Validatie van miRNA-kandidaten in de replicatie-groep via qPCR
[…]
Synthese van complementair DNA (cDNA), qPCR miRNA detektie en kwantificatie
[…] De qPCR werd voor elk staal in duplo uitgevoerd en het gemiddelde van de verkregen ‘cycle-threshold’s (CT) gebruikt voor de berekeningen. [‘cycle-treshold’ = aantal PCR-cycli waarbij het gegenereerd fragment significant boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer van het miRNA aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken]
Analyse van de qPCR-gegevens
[De 2 meest gebruikte methodes om gegevens van kwantitatieve PCR te analyseren zijn absolute en relatieve kwantificatie. De eerste bepaalt het ‘copy-number’ waarbij het PCR-signaal wordt uitgezet op een standaard-curve; de tweede bekijkt het PCR-signaal van het transcript in een groep t.o.v. dat van een ander staal (een controle). De 2(-Delta Delta C(T)) – 2-ΔΔCT -methode is een geschikte manier om de relatieve veranderingen in expressie te analyseren. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen); ΔΔCT = ΔCT(een doelwit-gen) minus ΔCT(een referentie-gen) – Δ staat voor verandering/verschil.]
De expressie-waarden van miRNAs in respons op de belasting werden gekwantificeerd via de ΔΔCT methode. Eerst werd ΔCT berekend door de CT-waarde van elk miRNA af te te trekken van die van de interne controle (cel-mir-39a-3p op T0) […]. De resultaten van de miRNAs op T90 werden op dezelfde manier genormaliseerd […]. Tenslotte werden de miRNA expressie-waarden in respons op de test van dezelfde patient geëvalueerd door de ΔΔCT te berekenen: ΔΔCT = ΔCTT90 – ΔCT0. Het verschil tussen de expressie van elk miRNA in elk staal t.o.v. de gemiddelde expressie van de controles werd geanalyseerd gebruikmakend van de 2-ΔΔCT methode op tweetijdstippen (T0 & T90). Eerst werden de resultaten van elk miRNA voor elk staal genormaliseerd met de resultaten van de exogene controle (cel-mir-39a-3p): ΔCTstaal = CTmiR – CTcel-miR-39a-3p. Dan werd de ΔΔCT voor elk staal berekend: ΔΔCT = ΔCTstaal – gemiddelde ΔCTcontroles. Tenslotte werd het verschil qua miRNA-expressie tussen elke deelnemer en het gemiddelde van de controles berekend: 2-ΔΔCT.
Constructie van gen-paden en -netwerken voor de ontregelde miRNAs bij M.E./CVS
De mogelijke doelwitten van miRNAs van belang – inclusief genen, molekulaire en fysiologische funkties – en M.E./CVS-gerelateerde ziekte en symptomen, werden hoofdzakelijk geïdentificeerd via uitgebreide literatuur-overzichten en manuele behandeling. De connecties (interakties) van de miRNAs en hun doelwitten werden geconstrueerd op basis van de ‘Ingenuity Knowledge Base’ d.m.v. de ‘Ingenuity Pathway Analysis’ (IPA) software.
‘Machine-learning’ en statistische analyses
Het ‘Random Forest Model’ (RFM) werd uitgevoerd om M.E./CVS te voorspellen. De gegevens werden willekeurig 80/20 opgesplitst in ‘training’- en ‘testing’-sets. Het RFM-model werd opgebouwd gebruikmakend van de ‘training’-gegevens en vervolgens getest op de overblijvende 20% gegevens van de ‘testing’-set. Om het RFM te evalueren, gebruikten we verschillende metingen om de klassificatie-prestaties te beoordelen, inclusief nauwkeurigheid, specificiteit, sensitiviteit en ‘receiver operating characteristic’ (ROC) curve [statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// ‘area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. De ROC curve toonde het compromis tussen sensitiviteit en specificiteit, en de ‘area under the curve’ (AUC) werd gebruikt als een index ter evaluatie van de voorspelling-prestaties van het panel van 11 miRNAs. We pastten de ‘K-means’ methode toe om de individuen te klassificeren in 4 clusters gebruikmakend van ΔΔCT-gegevens op basis van de signatuur van de 11 miRNAs. Het doel van ‘ K-means’ is om clusters van patiënten te definiëren, zodat we inzicht kunnen verwerven omtrent hun symptomen en andere klinische kenmerken. Gegevens uit vragenlijsten over M.E./CVS-symptomen betreffende deze 4 clusters werden statistisch geanalyseerd. P-waarden kleiner dan 0.05 werden als statistisch significant beschouwd.