Onderstaand artikel kwam mede tot stand door financiering van de ‘National Institutes of Health’ het ‘Solve ME/CFS Initiative’. Het onderzoek werd mede uitgevoerd door gerenommeerde M.E.(cvs)-onderzoekers. Maureen Hanson heeft overigens een zoon met de ziekte…

De voorbije jaren zijn er meerdere rapporten geweest over een verstoord metabolisme. De research hier bekeek deze problematiek gebruikmakend van een andere methodologie en de resultaten werden vergeleken met die van een paar andere groepen (in de tekst wordt dan ook veelvuldig verwezen naar Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 & Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480) en naar eerder werk van de eigen groep (Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9).

Het lijkt ons een zeer belangrijk artikel gebaseerd op degelijke wetenschap en waar een brede waaier aan metabolieten (mogelijke biomerkers) wordt bekeken. Ook al is het aantal onderzochte individuen niet ontzettend groot, toch werden enkele interessante bevindingen vastgesteld. Sommige van de biomerkers blijken weerom betrokken bij energie-produktie. Er werden ook vergelijkingen gemaakt met enkele andere ziekten en er blijkt weinig overlapping; d.w.z. M.E.(cvs) is anders dan die aandoeningen, de bevindingen lijken specifiek. Ook de gelijkenissen met resultaten van andere onderzoeksgroepen geeft het werk extra draagkracht; ook al betreft geen ‘echte replicatie’.

De researchers besluiten dat ze meer bewijsmateriaal aandragen voor een dysfunktioneel metabolisme bij M.E.(cvs), en meer bepaald een redox-onevenwicht. Bij redox (een samentrekking van reductie/oxidatie) -reakties verandert de oxidatie-toestand (lees: lading) van atomen. Er worden bij dit proces elektronen overgedragen/uitgewisseld. Eénvoudig gezegd: een atoom ondergaat ‘oxidatie’ (verliest elektronen), een ander ondergaat een ‘reductie’ (neemt elektronen op). In de tekst verwijst men naar de reeds veelvuldig vermelde oxidatieve stress bij ME.(cvs)…

————————-

Metabolites Vol 8, #4, p 90 (december 2018)

Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology

Arnaud Germain (1), David Ruppert (2), Susan M. Levine (1), Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

2 Department of Statistical Science and School of Operations Research and Information Engineering, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ziekte met een enigmatische oorsprong en zonder vastgestelde geneeswijze. De constellatie van symptomen ruïneert de levens van miljoenen mensen overal ter wereld. Er werd de laatste jaren een plethora aan hypothesen tevergeefs onderzocht: de biologische basis van deze invaliderende aandoening blijft een mysterie. In deze studie onderzochten we of er een verstoring is in de homeostase van metabole netwerken in het plasma van een groep met 32 vrouwelijke patiënten vergeleken met 19 gezonde vrouwelijke controles. Een uitgebreide analyse van de dataset met 832 metabolieten gegenereerd d.m.v. Metabolon®, (die 8 biologische klassen beslaat), leverde belangrijke inzichten op wat betreft metabole ontregelingen die voorkomen bij M.E./CVS. We rapporteren over 14 metabolieten die in verschillende hoeveelheden voorkomen, wat ons toelaat een theorie te ontwikkelen omtrent een omvangrijk redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten, dat consistent is met bevindingen van eerder werk op het gebied van M.E./CVS. Bovendien biedt de analyse informatie betreffende gelijkenissen tussen metabolieten-ontregelingen bij M.E./CVS en deze die voorkomen bij andere ziekten, terwijl de biomerker-analyse ervan toekomstige plasma-biomerkers voor M.E./CVS opleverden. Dit werk voegt belangrijke elementen toe aan de ontwikkeling van M.E./CVS-diagnostiek, een cruciale stap die nodig is voor het ontdekken van een behandeling.

1. Inleiding

[…] Hoewel gegevens die M.E./CVS-deficiënties beschrijven zich blijven opstapelen, is er nog steeds geen verklaring voor de vele symptomen van de ziekte.

We onderzochten de hypothese dat de homeostase van metabole netwerken bij M.E./CVS-patiënten is ontregeld in vergelijking met gezonde controles. Vele studies, o.a. door ons lab, hebben reeds gebruik gemaakt van de snel-evoluerende massa-spectrometrie voor de identificatie van metabolieten en hebben de samenstelling van metabolieten in het bloed bij meerdere afzonderlijke populaties bekeken. Er begint zich een consensus af te tekenen, waarbij gewijzigde mechanismen worden gemeld in verscheidene studies. Namelijk: meerdere studies hebben vastgesteld dat het metabolisme van lipiden, oxidatieve stress and energie relevant is bij M.E./CVS. Jammer genoeg werd niet één enkele of redelijk kleine set metabolieten bepaald als zijnde de basis metabole signatuur van deze aandoening. Niettemin werden statistisch significante verschillen qua plasma- of serum-metabolieten in meerdere groepen aangetoond, gebruikmakend van verscheidene metabolomica-instrumenten, door een reeks deskundige teams. Er werden ook verschillen tussen metabolieten-profielen van vrouwen en mannen met M.E./CVS gezien [Naviaux RK et al.].

In dit rapport werken we verder op 14 metabolieten die verschillend qua hoeveelheid bleken tussen onze vrouwelijke patiënten en gezonde controles, en connecteren deze bevinding met een groter beeld qua dysfunktie van metabole mechanismen. De in de kijker lopende mechanismen sturen ons begrip over de ziekte naar een effekt op redox-reakties, die een focus in verscheidene studies bleken [bv. Richards RS et al. Blood parameters indicative of oxidative stress are associated with symptom expression in Chronic Fatigue Syndrome. Redox. Rep. (2000) 5: 35-41 /// Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome: acute infection and history of physical activity affect resting levels and response to exercise of plasma oxidant/antioxidant status and heat-shock proteins. J. Intern. Med. (2012) 272: 74-84 (zie ook ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’) /// Fenouillet E et al. Association of biomarkers with health-related quality of life and history of stressors in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients. J. Transl. Med. (2016) 14: 251]. We tonen aan dat we onze eigen studies kunnen kruis-valideren met gegevens van gepubliceerde rapporten van andere onderzoekers. Het is onze bedoeling dieper onderzoek naar metabolomica bij M.E./CVS te inspireren, met het ontwikkelen van diagnostische testen als doel.

2. Resultaten

2.1. Onderzoeksgroepen

De stalen in deze studie zijn een subset van de populatie die werd geselekteerd voor onze darm-microbioom analyse en een uitbreiding van de piloot-groep die werd gebruikt in onze eerste metabolieten-analyse [Germain A et al.]. Het betreft in het totaal 19 controles en 32 patiënten, allen vrouwen, gematcht voor leeftijd [mediaan controles & patiënten: 50 jaar] en ‘body-mass-index’ (BMI) [mediaan: controles 26,1 – patiënten 24,4]. Alle patiënten voldeden aan de 1994 Fukuda definitie voor M.E./CVS […].

De demografische gegevens waren gelijkaardig met deze van de datasets van Naviaux et al. en Germain et al. wat betreft leeftijd en BMI. De populatie van Armstrong et al. was 15 jaar jonger (geen info over BMI).

2.2. Metabolieten-gegevens en statistische verwerking

Het Metabolon® platform liet de identificatie en meting toe van in het totaal 832 metabolieten […]. De metabolieten-klassen waren: aminozuren (177), koolhydraten (26), co-factoren & vitaminen (28), energie (10), lipiden (353), nucleotiden (29), peptiden (33) en xenobiotica (176). Deze acht super-mechanismen, zoals door Metabolon® gedefinieerd, kunnen verder worden onderverdeeld in 83 sub-mechanismen. […] Hoewel de namen van de meeste super-mechanismen duidelijk zijn, is het relevant om op te merken dat de categorie xenobiotica wordt gevormd door metabolieten behorend tot de volgende sub-mechanismen: benzoaat-metabolisme (11%), chemische stoffen (14%), medicijnen (40%), voeding-componenten/plantaardig (24%), tabak-metabolisme (2%) en xanthine-metabolisme (9%).

[…]

[…] Metabolon® super-mechanismen worden door Metabolon® gedefinieerd volgens uitgebreide ‘review’ van de literatuur maar uiteindelijk ‘in house’, aangezien er vanzelfsprekend meerdere mechanismen zijn waar een molekule kan worden gecategoriseerd. Super-mechanismen zijn het resultaat van een groepering van sub-mechanismen volgens hun belangrijkste kenmerk […]. Sub-mechanismen zijn het resultaat van de klassificatie van metabolieten in de voornaamste metabole mechanismen waartoe ze behoren, zoals overééngekomen bij metabolomica-normen. […]

Statistische verwerking vond 60 metabolieten (7% van de metabolieten-netwerken) met significante verschillen (p < 0.05). […] 50% van deze 60 behoren tot de lipiden-categorie en 15% tot de aminozuren-categorie.

Er werd een correctie uitgevoerd op de p-waarden om te controleren voor ‘false discovery rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]). […] Toegepast op elke biologische klasse metabolieten volgens Metabolon®’s nomenclatuur, kwamen we uit op 9 significant verschillende metabolieten (controles vs. patiënten) [zie hieronder].

2.3. Metabolieten die meest aangetast zijn bij M.E./CVS behoren tot 4 klassen

De 9 metabolieten die hieronder worden besproken, behoren tot de volgende 4 super-mechanismen: co-factoren & vitaminen, energie, nucleotiden en peptiden. […].

Vier van deze metabolieten worden geklassificeerd bij co-factoren & vitaminen. Haem, het pigment dat bloed z’n rode kleur geeft, is één van de meest statistisch verschillende metabolieten, dat veel meer voorkomt bij patiënten t.o.v. controles. Haem bestaat uit een ijzer-ion in het centrum van een grote organische ring en wordt vooral in haemoglobine gevonden, maar ook in enkele andere haemoproteïnen, met wisselende funkties die allemaal verband houden met redox-chemie. Vrij haem is zeer cytotoxisch en schadelijk voor weefsels door z’n pro-oxidatieve en pro-inflammatoire eigenschappen, aangezien het in staat is de vorming van vrije radikalen te katalyseren.

De andere drie metabolieten zijn onderdeel van het vitamine-E mechanisme en waren significant lager bij de patiënten. Vitamine-E [tocoferol] is een vet-oplosbaar anti-oxidant dat de verspreiding van reaktieve zuurstof-soorten door lipiden-membranen te belemmeren. Gamma-CEHC [carboxyethyl-hydrochroman] is de geoxideerde vorm van gamma-tocoferol uit de voeding en is anti-inflammatoir, de andere twee zijn glucuronide-conjugaten van alfa-CEHC en gamma-CEHC, allebei significant circulerend in het bloed.

Een andere metaboliet van belang is alfa-ketoglutaraat, één van de tien energie-metabolieten waar we gegevens over hebben in deze studie. Onze gegevens geven aan dat het hoger is bij de patiënten. Alfa-ketoglutaraat is een essentiële biologische molekule die wordt gevonden in veel biologische mechanismen, verbonden met het aminozuren-metabolisme en onderdeel van de TCA-cyclus, die zich afspeelt in de mitochondrieën, waar chemische energie wordt geproduceerd door de oxidatie van pyruvaat.

De volgende drie metabolieten behoren tot de klasse nucleotiden en komen alle drie minder voor bij patiënten vergeleken met controles. Er is niet veel geweten over 2’-O-methylcytidine, buiten het feit dat het onderdeel is van het pyrimidine-metabolisme. Aan de ander kant zijn adenosine-3’,5’-cyclisch monofosfaat (cAMP) en inosine-5’-monofosfaat (IMP) een deel van het purine-metabolisme, en beide geassocieerd met ATP/AMP, respectievelijk, en zijn zodoende gelinkt met het energie-metabolisme. Hoewel over de funktie van IMP in het bloed nog wordt gediscussieerd, staat cAMP bekend als een a centrale intracellulaire regulator die hormonale mechanismen beïnvloedt.

Ten slotte werd gamma-glutamyl-threonine, een dipeptide [2 aminozuren] uit de klasse peptiden, waarvan significant hogere bloed-waarden werden gedetekteerd bij de patiënten. Afgezien van het feit dat deze molekule een intermediair afbraak-produkt van proteïnen is, is weinig bekend aangaande z’n fysiologisch effekt in het bloed. Het wordt echter geciteerd in een patent als een potentiële biomerker voor lever-toxiciteit.

2.4. De MetaboAnalyst statistische analyse biedt bijkomend waardevol inzicht in de dataset

Dit instrument […] brengt enige biologische significantie in de statistische analyse. Een totaal van 7 metabolieten sprong er boven uit […], twee overlappen met de statistisch significante metabolieten hierboven beschreven: haem en IMP.

Alle andere hiermee geïdentificeerde metabolieten kwamen meer voor bij patiënten dan controles. Deze omvatten tauroursodeoxycholaat (TUDCA; zowel een cytoprotectief agens als een chemisch chaperone [molekule die helpt bij het vouwen of ontvouwen en het op- of afbouwen van macromolekulaire strukturen (proteïnen/DNA)]), 3-hydroxybutyrylcarnitine-1 & 3-hydroxybutyraat (BHBA; allebei betrokken bij ketose [verhoogde concentratie ketonen, veroorzaakt door afbraak van vetzuren], een metabool proces geassocieerd met energie en glucose), piperine (een alkaloïd dat wordt gevonden in kruiden en specerijen) en histamine (een molekule waarvan de betrokkenheid bij veel aspecten in het menselijke lichaam is gekend, inclusief lokale immuun-responsen, een werking als centrale neurotransmitter en een vasodilator).

2.5. De MetaboAnalyst aanrijking-analyse biedt ovetuigende met ziekte geassocieerde plasma metaboliten-sets

Het aanrijking-analyse instrument laat vergelijking toe tussen een te onderzoeken metabolieten-dataset […] en gekende, met ziekte geassocieerde metabolieten-sets. […] Hoewel dit instrument metabolieten identificeert die op de zelfde manier variëren als bij andere ziekten [o.a. obesitas, hart-falen, diabetes-ketoacidose, anoxie, …], is het niet de intentie dit te gebruiken om te impliceren dat alle metabolieten-veranderingen bij M.E./CVS identiek zijn met deze die voorkomen bij bepaalde andere ziekten.

[…] Eén van de intrigerende patronen is dat bij 4 van de 10 beschreven ziekten (40%), een dehydrogenase-, oxidase- of transferase-deficiëntie betrokken is. Die zijn allen mogelijks gelinkt met enig onevenwicht in de redox-toestand aangezien het zeer onwaarschijnlijk is dat ze het resultaat zijn van gen-mutaties in de verscheidene aangetaste mechanismen.

Omdat de statistische betrouwbaarheid van deze module na correctie slecht is […], voerden we dezelfde analyse uit op gepubliceerde datasets, inclusief ons eerder werk, waar een dergelijk instrument nog niet werd gebruikt. Dergelijke navorsingen gaven gelijkaardige resultaten maar met een grotere statistische ‘power’ voor sommige. We namen enkel de ziekten op waar minstens de helft van de metabolieten-veranderingen geassocieerd waren met het patient-fenotype, aangezien het instrument ook resultaten oplevert betreffende wijzigingen die enkel pertinent zijn voor de verschillen qua controle metaboliet-waarden. We hebben opzettelijk gekozen de afzonderlijke metabolieten die door deze module worden gebruikt niet te bespreken (aangezien het niet onze intentie is M.E./CVS te linken met deze ziekten) maar in plaats daarvan mogelijke trends wat ziekte-associatie te bekijken. We bespreken de mogelijke links tussen M.E./CVS-symptomen en gekende fysiologische dysfunkties hieronder.

Van de 10 metabolieten-sets van de Metabolon® dataset, waren er 6 aanwezig bij Armstrong et al. of Germain et al. Dit toont een sterke gemeenschappelijkheid, een kenmerk dat we verder zullen verkennen in 2.7.

Ons eerder werk geeft overvloedige voorbeelden van dehydrogenase-, carboxylase-, hydrolase- & transferase-aktiviteit deficiënties, enkele spier-gerelateerde aandoeningen door varianten van carnitine-deficiënties, en enkele suiker-gerelateerde onevenwichten. De Armstrong et al. dataset levert ook talrijke dehydrogenase- & carboxylase-defekten op. Globaal overheersen dehydrogenase-, transferase- & oxidase-deficiënties, en een dergelijk patroon leidt tot onze suggestie dat een algemeen onevenwicht een dergelijk type reakties belemmert.

Een opvallende aandoening die werd gevonden in de dataset-analyse is anoxie (samen met asfyxie [zuurstof-tekort/verstikking]), een extreme vorm van hypoxie, wanneer het lichaam (of een gebied) over extreem weinig zuurstof beschikt. Bij een gezonde persoon die lijdt onder hypoxie, treedt vermoeidheid, verwarring, hoofdpijn en dof gevoel in de ledematen op, allemaal symptomen die optreden bij M.E./CVS-patiënten. De zuurstof-status van weefsels kan mogelijks aangetast worden door de ontwrichting van de hoeveelheid haem die we beschreven. Gedaalde cerebrale bloeddoorstroming, die kan resulteren in inadequate brein-oxygenatie, is een hypothese gelinkt met de cognitieve stoornissen bij M.E./CVS-patiënten [Biswal B et al. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J. Neurol. Sci. (2011) 301: 9-11 /// Staud R et al. Task related cerebral blood flow changes of patients with Chronic Fatigue Syndrome: an arterial spin labeling study. Fatigue (2018) 6: 63-79].

Veel ziekten gerelateerd met ketose keren ook terug in de analyse en zijn het gevolg van een overmatige toename van ketonen in het bloed, een proces dat hierboven werd vernoemd bij het bespreken van 3-hydroxybutyraat (BHBA) en 3-hydroxybutyrylcarnitine-1. Bv.: diabetes-ketoacidose resulteert uit een onvermogen om koolhydraten te gebruiken voor energie-voorziening, leidend tot metabolisme van vetten en zodoende enige verstoring van het gebruik van koolhydraten bij M.E./CVS.

Ten slotte: persistente hyperinsulinemische [te veel insuline in het bloed] hypoglycemie bij kinderen (PHHI) was een andere ziekte die werd gevonden in twee datasets en die mogelijks kan worden gelinkt met hersen-aktiviteit. Andere ziekten die het vermelden waard zijn met betrekking tot hersen-funktie betreffen correlaties met metabolieten die worden gevonden bij schizofrenie, toevallen en epilepsie, alsook meerdere syndromen waarbij de gezondheid van de ogen betrokken is. In het bijzonder: een courant symptoom bij M.E./CVS-patiënten is de extreme gevoeligheid voor licht.

2.6. De MetaboAnalyst biomerker-analyse levert toekomstige (plasma)biomerkers op voor M.E./CVS

Het ‘machine-learning’ attribuut dat wordt gebruikt om het diagnostisch vermogen te illustreren is de ‘receiver operating characteristic’ curve (ROC-curve), die echt-positieven en vals-positiven integreert. De resulterende grafiek laat de berekening toe van een ‘area under the curve’ (AUC): hogere waarden wijzen op een hogere waarschijnlijkheid van accurate klassificatie van een staal.

De hoogste voorspellende waarden werden bereikt met pyroglutamine [metaboliet in de glutathion-cyclus] en haem: AUCs van 0.75.

Globaal waren er 24 metabolieten met een AUC boven 0.70 [AUC (maat voor diagnostische accuraatheid = 1 betekent perfekt; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] (inclusief haem, tauroursodeoxycholaat, gamma-CEHC, gamma-CEHC-glucuronide, IMP, alfa-ketoglutaraat, terwijl veel van de andere molekulen lipiden zijn).

2.7. Analyse geeft aan dat bijna 100% van de kruis-geïdentificeerde metabolieten een gelijkaardig statistisch gedrag vertoont tussen studies

De toepassing van metabolomica op M.E./CVS-stalen staat nog in z’n kinderschoenen: er zijn nog maar enkele studies gepubliceerd. Om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen research-teams, met afzonderlijke populaties en metabolieten-identificatie technologieën, te beoordelen, besloten we paarsgewijze vergelijkingen uit te voeren. Er dient te worden opgemerkt dat als de ziekte geen effekt vertoont in elk van de twee studies, dat onze test dan niet-significant zal zijn.

De eerste vergelijking was deze tussen onze Metabolon® dataset en Germain et al., die een kleinere maar gedeeltelijk overlappende populatie op een verschillende massa-spectrometrie platform gebruikte. De vergelijking betrof 149 metabolieten met dezelfde HMDB [‘Human Metabolome Database’] -identiteit. De hypothese die werd getest was dat het gemiddeld verschil […] tussen controles en patiënten dezelfde is voor beide studies. Geen van de gevonden metabolieten-patronen bleek te verschillen tussen de twee studies.

We gingen dan over tot het vergelijken van de volledige Metabolon® dataset met alle gegevens van Germain et al. In dit geval bleken 145 van de 149 metabolieten zich anders te gedragen […] op 4 uitzonderingen na: dihydrothymine [intermediair in het metabolisme van het nucleotide thymine], taurine [zwavel-bevattend organisch zuur met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie; bleek al van belang voor de differentiatie tussen FM en controles], spermidine [inhibeert stikstofoxide-synthase] en acetylcarnosine [anti-oxidant], die allen significant verschillend bleken tussen controles en patiënten bij Germain et al.

De volgende vergelijking betrof de volledige Metabolon® dataset en de vrouwen-dataset van Naviaux et al. Van de 154 metabolieten met dezelfde HMDB-identiteiten bleken er slechts twee, adenosine en flavine-adenine-dinucleotide (FAD), statistisch verschillend tussen de twee studies. Dit verschil kan te wijten zijn aan de afname-methode van het plasma (EDTA voor onze stalen, lithium-heparine bij Naviaux et al.).

Een andere vergelijking was een dataset van Armstrong et al. en de volledige Metabolon® dataset. Alhoewel slechts 26 metabolieten gemeenschappelijke HMDB-IDs hadden, gedroegen er zich 14 statistisch op dezelfde manier.

De uiteindelijke combinaties omvatten Germain et al. & Armstrong et al., Germain et al. & Naviaux et al., en Armstrong et al. & Naviaux et al.; en de resultaten waren zeer gelijkaardig: respectievelijk 87%, 98% en 91% van de metabolieten die zich statistisch niet verschillend gedroegen.

Belangrijk is het terugkerend verschijnen van hypoxanthine [afgeleide van purinen, bouwstenen van nucleïnezuren], een metaboliet dat significant verschillende bleek tussen de studies, samen met enkele andere metabolieten, altijd bij vergelijkingen met de Armstrong et al. dataset. Het is belangrijk om op te merken dat de Armstrong dataset werd verkregen via analyse van serum i.p.v. plasma (wat werd gebruikt bij alle andere studies). Alhoewel plasma en serum onderdelen van totaal bloed zijn, werden significante verschillen qua metabolieten-profielen aangetoond.

2.8. Hiërarchische clustering levert geen definitieve subgroep-identificatie op

Eén van de hypotheses betreffende M.E./CVS is dat verschillende fundamentele ontwrichtingen optreden in verschillende groepen patiënten die dezelfde invaliderende symptomen blijken te vertonen. De aanwezigheid van patiënten-subsets kan verklaren waarom statistische significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten als groep en een groep gezonde individuen soms niet worden gezien. Het bestaan van subgroepen patiënten-types werd ook gesuggereerd ter verklaring van het feit waarom tegenstrijdigheid tussen studies wordt vastgesteld voor sommige metingen en waarom de responsen op behandeling verschillen tussen patiënten-populaties.

Er werd een ‘clustering’-analyse op de Metabolon® dataset uitgevoerd in een poging om potentiële onderscheidende metabole signaturen binnen de patiënten-populaties te identificeren. Er werd geen significant resultaat gevonden: noch bij gebruik van de volledige set metabolieten, noch bij de individuele super-mechanismen. Hetzelfde besluit werd bereikt wanneer de analyse geïmplementeerd werd op de controle-groep (gegevens niet getoond).

Er werd een identieke ‘clustering’-analyse uitgevoerd op elk van de andere drie beschikbare datasets, voor dewelke geen super-mechanisme klassificatie beschikbaar was. Bij gebruik van enkel de patiënten van Germain et al., lagen de p-waarden tussen 0.940 en 0.954 (mediaan 0.946). Voor de Naviaux et al. dataset lagen de p-waarden tussen 0.990 en 0.998 (mediaan 0.992). Voor Armstrong et al. lagen de p-waarden tussen 0.008 en 0.032 (mediaan 0.020), wat maakte dat dit de enige dataset was waar subgroepering evident was. Om deze bevinding verder te onderzoeken, werd hiërarchische ‘clustering’ toegepast op de Armstrong at al. dataset […]. We zagen slechts twee individuen die zich ietwat onderscheiden van de rest; […] er was slechts zwak bewijs voor subgroepering. […]

3. Bespreking

De grootte van de populatie van deze studie is vergelijkbaar met gepubliceerd werk zoals door Naviaux et al. & Armstrong et al., en is een uitbreiding van de groep die we gebruikten voor onze eerdere poging. Bovendien is het substantieel aantal gekwantificeerde metabolieten (832) opmerkelijk groter dan de 420 molekulen van Naviaux et al., de 361 van Germain et al. of de 29 van Armstrong et al. Ongetwijfeld werd de statistische ‘power’ van onze analyse verzwakt door de combinatie van een populatie van 51 individuen en een reeks van 832 metabolieten, wat het beperkt aantal metabolieten verklaart die we als significant verschillend kunnen bestempelen […]. Niettemin werpen onze bevindingen, door de uitgebreide analyse van onze dataset, een licht op een intrigerend aspect van het dysfunktioneel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten, met betrekking tot de redox-toestand.

Van de vier verstoorde biologische klassen in onze groep, bevatten de categorieën ‘nucleotiden’ en ‘peptiden’ metabolieten die potentieel brede repercussies hebben op biologische funkties. Bv.: cAMP en IMP zijn molekulen waarvan is geweten dat ze betrokken zijn bij veel aspecten van het funktioneren van het menselijk lichaam, zoals purine-metabolisme, opslag van chemische energie in spieren en intracellulaire signaal-overdracht. Het is daarom ontzettend moeilijk een uniek mechanisme gelinkt met M.E./CVS-toestand of -symptomen op basis van dergelijke molekulen of, anderzijds, molekulen waarvan weinig of niets is geweten (zoals 2’-O-methylcytidine of gamma-glutamylthreonine) aan te wijzen. Deze laatste molekule wordt echter in een patent genoemd als potentieel belangrijke molekule (onder andere biomerkers) ter bepaling van lever-toxiciteit. De resultaten van ons eerder werk focusten op biomerkers voor lever-letsel.

Een ander zeer belangrijk metaboliet is alfa-ketoglutaraat omdat het deel uitmaakt van het ‘energie’ super-mechanisme en de TCA cyclus. Inderdaad: de Krebs-cyclus is een mechanisme dat consistent aan de oppervlakte komt bij M.E./CVS-metabolomica analyse. Omdat vermoeidheid een belangrijk uitputtend symptoom van deze ziekte is, werd lang gespeculeerd dat het energie-metabolisme van de patiënten dysfunktioneel is. Verscheidene studies wijzen op een directe manier naar een abnormaal energie-metabolisme te wijten aan falende TCA- en ureum-cycli of indirect via een vermoedelijke stoornis van pyruvaat-dehydrogenase [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990]. Een piloot-studie met een gepatenteerd voedingsupplement waarvan wordt gesteld dat het de aktiviteit van dit enzyme – en bijgevolg de Krebs-cyclus – aanwakkert, beschrijft substantiële verbeteringen van de gezondheid en conditie van behandelde patiënten [Comhaire F. A novel nutriceutical treatment of Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”. Intern. Med. (2017) 7: 5 (zie ook ‘Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?’)]. Niettemin is alfa-ketoglutaraat betrokken bij talrijke metabole mechanismen (zoals het carnitine-metabolisme, lysine-metabolisme en dat van de vertakte aminozuren, om er enkele te noemen), zodat een focus op één enkel mechanisme als basis voor de invaliderende symptomen van M.E./CVS tot nu toe niet gerechtvaardigd is.

De categorie ‘co-factoren en vitaminen’ omvat metabolieten met ongelijksoortige eigenschappen, zoals geïllustreerd door haem & gamma-CEHC. In onze groep werden hogere waarden van haem, onderdeel van het haemoglobine- en porfyrine-metabolisme, en lagere waarden van gamma-CEHC, onderdeel van het tocoferol-metabolisme, gemeten bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Haem is een vitale component van vele metalloproteïnen (met haemoglobine als best bekende) en wordt gesynthetiseerd in de lever en het beenmerg. Aangezien de staal-voorbereiding bij Metabolon® op methanol is gebaseerd, wordt precipitatie van proteïnen verwacht maar aan proteïnen gebonden haem kan dan nog worden afgegeven […]. Omdat we plasma (cel-vrij) gebruikten, wordt er een grotere bijdrage van ‘vrij haem’ aan de meting van de hoeveelheid haem geanticipeerd, tenzij er substantiële haemolyse [kapotgaan van rode bloedcellen waardoor haemoglobine in het bloed terecht komt] optrad. Een hoge concentratie vrij haem in het plasma is een biomerker voor de ernst van sikkelcel-ziekte [rode bloedcellen hebben een abnormale vorm door abnormaal haemoglobine], waarbij gestegen waarden qua inflammatoire biomerkers zoals lactaat-dehydrogenase, bilirubine, een hoog aantal reticulocyten [voorlopers van rode bloedcellen] en lipiden worden gedetekteerd. We bepaalden drie vormen van bilirubine en biliverdine [afbraakprodukten van haemoglobine] in onze stalen die ook meer aanwezig bleken bij patiënten vs. controles; wat wijst op een algemene verstoring van het haem-afbraak mechanisme, waarvan de laatste stap in de lever gebeurt. Alle vijf molekulen hebben sterk nadelige effekten die verbonden zijn met het genereren van vrije radikalen en er wordt beweerd dat hun afbraak onderdeel is van een cel-beschermende feedback in respons op oxidatieve stress. In tegenstelling daarmee zijn gamma-CEHC, samen met gamma-CEHC-glucuronide en alfa-CEHC-glucuronide (metabolieten van het vitamine-E mechanisme), dat anti-inflammatoire kenmerken heeft (zoals een werking als lipofiel anti-oxidant). Ons eerder werk [piloot-studie; zie ref. in onze inleiding] suggereerde ook een ontwrichting van het vitamine-E metabolisme ten gevolge de detektie van [z’n metaboliet] 13’-carboxy-alfa-tocoferol, wat jammer genoeg niet aanwezig is in deze dataset.

Veel M.E./CVS-patiënten rapporteren zelf dat gespecialiseerde diëten en supplementen hun symptomen verlichten. Dergelijk gedrag is wijdverspreid in patiënten-gemeenschappen van veel ziekten, inclusief M.E./CVS, fibromyalgie en kanker (om er maar enkele te noemen) [bv. Craig C. Mitoprotective dietary approaches for Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome: Caloric restriction, fasting and ketogenic diets. Med. Hypotheses. (2015) 85: 690-693 /// Lopez-Rodriguez MM et al. Patterns of food avoidance and eating behavior in women with fibromyalgia. Endocrinol. Diab. Nutr. (2017) 64: 480-490]. Gezien de exclusie van voorgeschreven farmaceutica, kunnen dergelijke voeding-benaderingen worden gedefinieerd als voeding-restricties of geassocieerd met specifieke supplementen waarvan wordt gedacht dat ze voordelige effekten tegen inflammatie, cardiovasculaire problemen of veroudering opleveren. Er werd door andere patiënten gerapporteerd dat het diëten om een mogelijke tarwe-gevoeligheid bij sommigen te verbeteren of ketogene dieten en vasten, nuttig zijn. Veel patiënten beschouwen enkele supplementen (inclusief NADH, coenzyme-Q10 of polyfenolen) nuttig, hoewel systematisch beoordeling van studie-uitkomsten geen aanleiding geeft tot duidelijke aanbevelingen. Een gemeenschappelijk iets in al het geciteerde werk aangaande voeding bij M.E./CVS kan echter worden gevonden in het redox-metabolisme. Het is duidelijk dat ons huidig werk en andere rapporteren suggereren dat nutritionele veranderingen van nut kunnen zijn voor patiënten, hoewel verder onderzoek nodig is vooraleer aanbevelingen kunnen worden gemaakt.

Een ambitieus doel wat betreft de toepassing van ongerichte metabolomica op M.E./CVS-stalen is het peilen naar een patroon dat ons beperkt begrip van deze ziekte kan uitbreiden. De aanrijking-analyse ‘unit’ van MetaboAnalyst onthulde een mogelijk onevenwicht in de redox-toestand van de patiënten, aangezien hun metabole profielen overéénkwamen met meerdere aandoeningen die niet gerelateerd zijn met elkaar, maar waar bij alle redox enzymatische reakties betrokken zijn. Onze hypothese is dat een verstoring van de redox-toestand de status van donoren en acceptoren van chemische reakties aslook hun co-enzymen (zoals NAD+/NADH, FAD+/FADH voor dehydrogenasen) beïnvloedt. Oxidasen zouden vanzelfsprekend ook aangetast zijn als katalysatoren van redox-reakties. Veel transferase katalytische aktiviteiten kunnen worden beïnvloed door de redox-toestand van hun omgeving en veel ziekten worden veroorzaakt door transferase-deficiënties. Bv.: succinyl-CoA:3-ketoacid-CoA transferase deficiëntie leidt tot een toename van ketonen en diabetes-ketoacidose […]. Carnitine-palmitoyl-transferase deficiëntie II (CPT II) is een ander voorbeeld waarbij het vetzuren-metabolisme ontwricht is door het gebrek aan transport van lange-keten vetzuren naar de mitochondrieën, waar ze worden gebruikt als brandstof-bron.

Anoxie is één van de met ziekte geassocieerde metabolieten-sets, een aandoening die ook opdook gebruikmakend van de Armstrong et al. dataset (gegevens niet getoond), en samen met asfyxie in de Germain et al. dataset (gegevens niet getoond). Het M.E./CVS metabolieten-profiel vertoont ook gelijkenissen met dat van kinderen die hypoxisch-ischemische encefalopathe (HIE) ontwikkelen door zuurstof-deprivatie. Anoxie en asfyxie zijn beide verbonden met het gebrek aan zuurstof, wat duidelijk ernstige repercussies kan hebben op spier- en lichamelijke aktiviteit. Het onvermogen om adequaat zuurstof te leveren aan spieren is evident in studies van de respons op inspanning bij in M.E./CVS-patiënten [bv. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93 /// Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492]. Bovendien is de oxygenatie van de pre-frontale cortex in het brein verminderd bij inspanning in M.E./CVS-patiënten [Neary JP et al. Prefrontal cortex oxygenation during incremental exercise in Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Physiol. Funct. (2008) 28: 364-372]. Veel personen met M.E./CVS vertonen een gedaald bloed-volume, wat de oxygenatie van veel weefsels aantast [Streeten DHP et al. The roles of orthostatic hypotension, orthostatic tachycardia and subnormal erythrocyte volume in the pathogenesis of the Chronic Fatigue Syndrome. Am. J. Med. Sci. (2000) 320: 1-8 /// Streeten DHP & Bell DS. Circulating blood volume in Chronic Fatigue Syndrome. Fatigue (2011) 4: 3-11]. Verstoringen van de circulatie en zuurvoorziening naar de weefsels kan aan de basis liggen van veel symptomen van M.E./CVS. Hypoxie resulteert in het genereren van reaktieve zuurstof-soorten in de mitochondrieën, met als gevolg de aktivatie van beschermende systemen.

Er werd een verband van oxidatieve stress met M.E./CVS gerapporteerd in een aantal M.E./CVS-studies. Van belang: bij het meten van gekende merkers voor oxidatieve stress, vonden Richards et al. [zie ref. hierboven] dat methaemoglobine [ontstaat als het tweewaardig ijzer (Fe²⁺) in haemoglobine door oxidatie wordt omgezet in driewaardig ijzer (Fe³⁺)] één van de voornaamste componenten was die hun M.E./CVS-patiënten van controles differentieerden. Deze vorm van haemoglobine draagt de geoxideerde vorm of het ijzer-ion […] die nodig is opdat haemoglobine zuurstof kan binden. Zelfs al maken methaemoglobine-metingen geen deel uit van onze dataset, is het intrigerend om de oxidatie-toestand te verbinden met een verstoord redox-milieu, terwijl het effekt van het onvermogen zuurstof te binden zich kan vertalen naar anoxie en asfyxie.

M.E./CVS-biomerkers, als een middel voor ondubbelzinnige diagnose en monitoring van de doeltreffendheid van behandelingen, zijn één van de dringend noodzakelijke ontwikkelingen op dit gebied. Er werden ROC-analyse gegevens gegenereerd met doel in gedachten. De hoogste voorspellende waarde bleek 0.75 AUC [zie resultaten]. Toekomstig werk waarbij een grotere en onafhankelijke groep wordt geanalyseerd en vergeleken met andere vermoeiende ziekten zal waarschijnlijk de voorspellende waarde verhogen en onthullen of plasma metabolomica kunnen dienen als betrouwbaar instrument voor objectieve identificatie en monitoring van M.E./CVS-patiënten.

4. Materialen & methodes

4.1. Staalname & metabolomica-platform

[…] Metabolon® ‘Global Metabolomics’: ‘ultra-high-performance’ vloeistof-chromatografie/ tandem massa-spectrometrie (UHPLC/MS/MS) laat accurate relatieve kwantificatie van honderden metabolieten uit verscheidene categorieën molekulen.

4.2. Gegevens-analysis via MetaboAnalyst

[…] Een uitgebreid instrument voor metabolomica-analyse en -interpretatie (www.metaboanalyst.ca).

4.3. Interne gegevens-analysis

[…]

5. Besluiten

In deze studie rapporteren we over een metabolomica-profiel van een relatief kleine groep. Ondanks statistische uitdagingen, leveren we toch meer bewijsmateriaal voor een redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten. De rationale achter onze theorie wordt ondersteund door parallellen met onze eerdere studie en beschikbare datasets van andere teams. De patiënten-groepen die in onze studies en die van anderen werden gebruikt, verschillen qua geografische ligging, dieet, behandel-regimes, maar toch zijn er opmerkelijke gelijkenissen bij de bevindingen. Zodoende kunnen metabolomica een fundamenteel kenmerk onthullen van de ontwrichting die optreedt in slachtoffers van M.E./CVS.