Exocytose is het proces waarbij een cel stoffen overbrengt naar het celmembraan of het extracellulair milieu. De af te geven stoffen worden verpakt in blaasjes (vesikels) die naar het celmembraan worden getransporteerd en er mee samensmelten. Endocytose is het proces waarbij de cel stoffen opneemt die door het celmembraan werden ingesloten. De stoffen die er door mogen, worden ingesloten doordat het celmembraan verder naar binnen toe instulpt tot dat het uiteindelijk een vesikel (endosoom) vormt.
Extracellulaire vesikels – microvesikels (circulerende, extracellulaire vesikels, 50-1000 nm), exosomen (intracellulair gegenereerde, door cellen afgegeven vesikels; 30-100 nm) en apoptotische lichamen (door apoptose geproduceerde fragmenten) – worden door veel, zo niet alle, celtypes afgegeven in het extracellulair milieu. Deze gesekreteerde vesikels bereiken lichaamsvochten en circuleren door het ganse lichaam waardoor ze kunnen interageren met veel verschillende cellen. Ze blijken een rol te spelen in de intercellulaire communicatie omwille van het doorgeven van de molekulen die er in zitten (via directe interaktie tussen een proteïne op het vesikel-membraan en één op het membraan van de ontvanger, of door internalisatie van de vesikel-inhoud door de recipient-cel) en de eigenschap om de werking van de ontvangende cel te veranderen.
Het zijn vehikels voor intercellulaire transfer van funktionele membraan- en cytosol-proteïnen, lipiden en nucleïnezuren. Naar gelang hun oorsprong, samenstelling, grootte en densiteit worden ze microvesikels, ectosomen (extracellulaire vesikels afgesplitst van het plasma-membraan), ‘shedding’ (afgeworpen) vesikels, micropartikels of exosomen genoemd.
In onderstaande studie werd voor het eerst (m.b.v. vrij eenvoudige technieken) maar bij een zeer beperkt aantal M.E.(cvs)-patiënten gekeken naar het voorkomen van extracellulaire vesikels; de resultaten geven dus zeer preliminaire indicaties…
————————-
Journal of Extracellular Vesicles Vol 7, #1 (maart 2018)
Circulating extracellular vesicles as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: An exploratory pilot study
Jesús Castro-Marrero (a), Esther Serrano-Pertierra (b), Myriam Oliveira-Rodríguez (b), Maria Cleofé Zaragozá (a,c), Alba Martínez-Martínez (a), María del Carmen Blanco-López (b) & José Alegre (a)
(a) CFS/ME Unit, Internal Medicine Service, Vall d’Hebron University Hospital Research Institute, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain
(b) Department of Physical and Analytical Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Oviedo, Oviedo, Spain
(c) Clinical Research Department, Laboratorios Viñas [farmaceutisch bedrijf], Barcelona, Spain
Samenvatting
Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) is een verworven, complexe en multi-systeem aandoening met een onbekende etiologie, zonder gevestigde diagnostische laboratorium-testen en zonder universeel erkende medicijnen voor behandeling. CVS/M.E. wordt gekenmerkt door onverklaarde invaliderende vermoeidheid en wordt dikwijls vergezeld door talrijke kern-symptomen. Steeds meer bewijsmateriaal suggereert dat extracellulaire vesikels (EVs) een rol spelen bij de communicatie tussen cellen, en betrokken zijn bij fysiologische en pathologische processen. Tot op heden zijn geen gegevens beschikbaar betreffende EV-biologie bij CVS/M.E. Het doel van deze studie het isoleren en karakteriseren van EVs in het bloed bij CVS/M.E. Er werden bloedstalen afgenomen bij 10 Spaanse CVS/M.E.-patiënten en 5 gematchte gezonde controles (HCs), en er werden EVs geïsoleerd uit het serum. Ook de proteïnen-lading, grootte en concentratie werd gemeten. Verder werden EVs onderworpen aan een immuno-assay voor de biomerkers CD9 & CD63. We vonden dat de EV-fraktie significant hoger was bij de CVS/M.E.-individuen dan bij de HCs (p = 0.007) en dat EVs significant kleiner waren bij de CVS/M.E.-patiënten (p = 0.014). Circulerende EVs zouden een nieuw instrument kunnen zijn bij biomedische research omtrent CVS/M.E. Deze bevindingen leveren preliminair bewijs dat EVs uit het bloed CVS/M.E.-patiënten kunnen onderscheiden van HCs. Dit zou nieuwe opportuniteiten kunnen bieden en een nieuwe deur kunnen open naar de identificatie van nieuwe potentiële biomerkers en therapeutische benaderingen voor de aandoening.
Inleiding
[…]
Er werden veel studies uitgevoerd omtrent Extracellulaire Vesikels (EVs) in de biomedische research. Sekretie van EVs en EV-gemedieerde mechanismen staan bekend als belangrijke spelers bij een waaier aan biologische processen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De lading van EVs van donor-cellen zouden kunnen interageren met die van recipient-cellen, wat hen tot potentiële intercellulaire mediatoren maakt. Er worden meerdere proteïnen zoals ‘heat-shock’ proteïnen [de ‘heat-shock’ respons is een universeel en essentieel adaptief mechanisme dat cellen toelaat te reageren op een brede waaier van schadelijke condities], integrinen [extracellulaire matrix proteïnen betrokken bij cel-adhesie, aktiveren ook signalisering-mechanismen voor cel-groei en -regulering in het cytosol] en tetraspaninen [familie van membraan-proteïnen] aangetroffen in alle EVs. Bovendien worden de tetraspaninen CD9 [adhesie-molekule op het cel-oppervlak], CD63 [trans-membraan-proteïne] & CD81 [ook een cel-oppervlakte proteïne] courant gebruikt als conventionele EV-merkers aangezien deze aangerijkt zijn in hun membranen.
Daarnaast kunnen EVs in gewijzigde aantallen en samenstellingen voorkomen bij meerdere aandoeningen [o.a. kanker] en ze duiken op als potentiële biomerkers voor diagnose en prognose. Tot op heden zijn er geen publicaties aangaande de isolatie en karakterisatie van EVs bij CVS/M.E. Aangezien de patho-mechanismen van CVS/M.E. die in de literatuur worden beschreven de afgifte van EVs kunnen bevorderen, stellen we voor circulerende EVs bij CVS/M.E. te karakteriseren om hun potentieel als biomerkers voor deze aandoening te bepalen.
In deze ‘proof of concept’ studie, isoleerden we serum-EVs van CVS/M.E.-individuen en gezonde controles (HCs) om ze te karakteriseren qua grootte en concentratie. We analyseerden ook hun samenstelling d.m.v. een immuno-assay (LFIA [‘lateral flow immuno-assay’; zie methodes]) dat werd geoptimaliseerd voor een snelle detektie.
Patiënten & methodes
[…]
Deelnemers
Er werden 10 in aanmerking komende Kaukasische vrouwen met CVS/M.E. (gemiddelde leeftijd 46,3 ± 8,5 jaar) gerecruteerd op basis van de 1994 CDC/Fukuda definitie […]. Er werden ook 5 gematchte sedentaire niet-vermoeide gezonde controles (HCs) (gemiddelde leeftijd 44,2 ± 6,2 jaar) in de studie opgenomen. De exclusie-criteria waren co-morbide psychiatrische ziekte, endocrino-metabole, haematologische en auto-immune aandoeningen, cardiovasculaire ziekte, zwangerschap of borstvoeding, drug-misbruik, roken of CVS/M.E.-symptomen die niet overéénstemmen met de 1994 CDC/Fukuda definitie.
Staal-afname & -verwerking
[…] 12 h vasten. […]
Isolatie van EVs
[…]
EV-karakterisatie
Proteïnen-kwantificatie en ‘western blot’ analyse
[methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen; de proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom, op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten]
[…]
‘Nanoparticle-tracking’ analyse (NTA)
[methode voor het visualiseren en analyseren van partikels in vloeistoffen op basis van de Brownse beweging – willekeurige beweging die het resultaat is van botsingen van snel-bewegende molekulen; zo kan men de grootte-distributie-profiel bepalen van partikels met een diameter van ca. 10-1000 nm]
[…]
‘Lateral flow’ immuno-test
Bepaling van CD9 & CD63 in gezuiverde EVs d.m.v. monoclonale antilichamen […] op een immunostrip [‘papier’-strookje waarop lijntjes verschijnen voor een positieve test en controle] […].
Statistische analyse
[…] p < 0.05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten & bespreking
Bepaling van de hoeveelheid proteïnen en detektie van CD63 EV-frakties
[…] We vonden een significant hogere hoeveelheid proteïnen bij de CVS/M.E.-patiënten dan in bij de controles (65,49 ± 10,75 mg/ml vs. 43,62 ± 5,10 mg/ml; p = 0.001). […]. De analyse van de hoeveelheid EV-proteïnen kan differentiëren tussen CVS/M.E.-individuen en controles. Er werd gerapporteerd dat de inhoud van EVs hoger is bij bepaalde aandoeningen van het centraal zenuwstelsel. Dit zou kunnen dienen als een biomerker bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten voor vroege stadia van CVS/M.E. Onze studie toonde een significante overvloed van bloed-EVs bij CVS/M.E.-individuen: gemiddeld een 1,5-voudige toename t.o.v. HCs.
We bepaalden ook de aanwezigheid van de courant gebruikte merker CD63 in de gezuiverde EV-frakties. Aangezien ons LFIA-systeem voor de detektie van EVs anti-CD63 als detektie-antilichaam gebruikt, checkten we daarnaast of de waarden van dit tetraspanine in onze CVS/M.E.-groep voldeden om deze benadering te gebruiken. We analyseerden gelijke volumes van elk staal d.m.v. ‘western blot’. De waarden van CD63 waren ook hoger bij CVS/M.E.-patiënten dan voor de controle-groep, hoewel het verschil niet statistisch significant was.
Karakterisatie van EVs van CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles
Geïsoleerde EV-frakties werder verder gekarakteriseerd d.m.v. analyse van grootte-distributie en concentratie via NTA. Op basis van de gemiddelde diameter gemeten in beide groepen, zien we dat de populatie partikels nogal homogeen was qua grootte van circulerende EVs bij CVS/M.E.-patiënten (103-183 nm) maar de EVs geïsoleerd bij HCs waren meer heterogeen verdeeld (diameters van 140 tot 271 nm). EVs van de controle-groep waren significant groter dan deze van CVS/M.E.-individuen (p = 0.014). Betreffende de concentratie geïsoleerde EV-frakties vonden we een groter aantal partikels bij CVS/M.E.-patiënten dan bij controles (1015 partikels/ml vs. 4,88×1012 partikels/ml; p = 0.007).
Er wordt momenteel aanvaard dat de grootte van EVs van endocytische oorsprong (exosomen) typisch 30-150 nm is. Onze resultaten geven aan dat EV-frakties van CVS/M.E.-patiënten rijk zijn aan exosomen in vergelijking met HCs, waarbij we grotere diameters vonden die kunnen grotendeels met microvesikels overéénkomen. EVs zijn naar voren tredende doelwitten voor biomedische research en deze bevindingen betekenen het eerste bewijs voor het feit dat het aantal circulerende EVs CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles kan onderscheiden.
Detektie van EVs die het tetraspanine CD9 tot expressie brengen
Bij het bestuderen van EV-biologie is hun isolatie even uitdagend als hun detektie. In dit opzicht biedt LFIA een krachtig instrument voor goedkope ‘on-site’ detektie. In deze studie werd LFIA-analyse uitgevoerd om een snelle detektie van circulerende EVs na isolatie toe te laten. Als detektie-antilichaam werd anti-CD63 gebruikt en anti-CD9 als het capterend antilichaam geprint in de test-lijn, anti-IgG werd gebruikt voor de controle-lijn. […] Serum dat werd ontdaan van EVs werd gebruikt als een negatieve controle. […]
[…] Het is meldenswaardig dat slechts 1 μl van de frakties nodig was om een zichtbaar signaal te verkrijgen (rode lijn) en zodoende EVs te detekteren. We vonden geen significante verschillend qua intensiteit van het CD9-signaal voor de EV-aangerijkte frakties tussen CVS/M.E.-patiënten en HCs. Dit impliceert vragen omtrent het gebruik van CD9 als een standaard exosomale merker voor CVS/M.E. EVs; aangezien het expressie-niveau van dit tetraspanine niet significant verschillend was tussen beide groepen. Het LFIA-platform werd gebruikt als een initiële benadering en het is geschikt voor snelle detektie van EVs, zoals eerdere gerapporteerd. Ons LFIA-systeem kan verder worden geoptimaliseerd of aangepast om andere biomerkers te detekteren. Daarom beschouwen we het als een goed startpunt. Niettemin zijn verdere studies met meer CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles nodig om mogelijke verschillen betreffende de aanwezigheid van andere tetraspaninen of andere in EV ingekapselde merkers (o.a. DNA, RNA, lipiden, proteïnen, cytokinen en metabolieten) te exploreren.
Besluiten
Dit rapport is het eerste dat aantoont dat de aantallen bloed-EVs verhoogd zijn bij patiënten met CVS/M.E., wat wijst op hun mogelijke betrokkenheid bij ziekte-pathogenese. Deze beloftevolle bevinding biedt wellicht niet enkel inzichten in de mechanismen betrokken bij de ziekte maar toont ook dat EVs nuttig kunnen zijn bij de vroege diagnose. Bovendien kan de isolatie van circulerende EVs gekoppeld aan ons prototype voor de detektie ervan via LFIA een krachtig (één enkele stap en in minuten) diagnostisch instrument vormen. We besloten dat EVs een cruciale rol kunnen spelen bij CVS/M.E. Studies met grotere groepen, meer uitkomst-metingen en verschillende studie-ontwerpen (cross-sectioneel vs. longitudinaal) zijn nu dringend vereist. Deze studies zouden subgroepen moeten opdelen volgens ziekte-aanvang en -progressie, en patiënten beoordelen bij ‘baseline’ en na inductie van post-exertionele malaise (via de 2-dagen cardiopulmonaire inspanning test [‘fiets-test’ op 2 opéénvolgende dagen]).