Op deze pagina’s hadden we ’t reeds over ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’, ‘MicroRNAs: Potentiële diagnostische biomerkers in NK-cellen bij M.E.(cvs)’ & ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’. miRNAs beïnvloeden de expressie van genen en dus de aanmaak van proteïnen (aan- of afzetten).
Professor James Baraniuk (‘Georgetown University’) rapporteerde ook al over studies bij veteranen met Golf Oorlog Ziekte (‘Gulf War Illness,’ GWI) (zie ‘Verband hersen-dysfunktie & post-exertionele malaise bij Golf Oorlog Ziekte’) en M.E.(cvs) ‘zie ‘CVS-gerelateerd proteoom in cerebrospinaal vocht’.
In onderstaande studie vergeleken de auteurs miRNA-patronen in ruggemerg-vocht (cerobrespinaal vocht; CSV) bij deze ziekten, voor en na inspanning. Vóór een fiets-inspanning waren de miRNA-waarden bij alle deelnemers hetzelfde; erna waren er significante verschillen. Controles, GWI-veteranen en M.E.(cvs)-patiënten vertoonden afzonderlijke verandering-patronen. Bij M.E.(cvs) waren er bv. 12 miRNAs verlaagd na inspanning. De auteurs lieten noteren dat “deze door inspanning geïnduceerde miRNA-patronen wijzen op andere mechanismen voor post-exertionele malaise, niettegenstaande de overlappende symptomen”.
Opmerking: Baraniuk & Shivapurkar hebben enkele patenten omtrent deze materie op hun naam…
————————-
Scientific Reports 7, Article: 15338 (november 2017)
Exercise-induced changes in cerebrospinal fluid miRNAs in Gulf War Illness, Chronic Fatigue Syndrome and sedentary control subjects
James N. Baraniuk, Narayan Shivapurkar
Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Department of Medicine, Georgetown University, Washington, District of Columbia, United States of America
Samenvatting
Golf Oorlog Ziekte (GWI) en Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) hebben gelijkaardige profielen met pijn, vermoeidheid, cognitieve dysfunktie en exertionele uitputting. Post-exertionele malaise suggereert dat inspanning het funktioneren van het centraal zenuwstelsel verandert. Er werden lumbaal-punkties uitgevoerd bij GWI-, CVS- en controle-individuen na (i) overnacht rust (‘non-exercise’) of (ii) submaximale fiets-inspanning. Inspanning induceerde posturale tachycardie bij een derde van de GWI-individuen (‘Stress Test Activated Reversible Tachycardia’, START). De rest waren ‘Stress Test Originated Phantom Perception’ (STOPP) individuen. MicroRNAs (miRNA) in het cerebrospinaal vocht werden vermenigvuldigd d.m.v. kwantitatieve PCR. De concentratie waren gelijkwaardig voor de ‘non-exercise’ GWI (n = 22), CVS (n = 43) en controle (n = 22) -groepen. Na inspanning vertoonden de START (n = 22) significant lager miR-22-3p dan de controles (n = 15) en STOPP (n = 42), maar hoger miR-9-3p dan STOPP. Alle groepen hadden significant gedaald miR-328 en miR-608 na inspanning vergeleken met de ‘non-exercise’ groepen; dit zouden merkers kunnen worden voor inspanning-effekten op de hersenen. Er waren 6 miRNAs significant verhoogd en 12 verminderd bij START, STOPP en controles na inspanning t.o.v. de ‘non-exercise’ groepen. Bij CVS waren 12 miRNAs verlaagd na inspanning. Ondanks de overlappende symptomen bij CVS, GWI en andere ziekten, duiden door inspanning geïnduceerde miRNA-patronen in het cerebrospinaal vocht op onderscheidende mechanismen voor post-exertionele malaise bij CVS, en de START- en STOPP-fenotypes van GWI.
Inleiding
[intro over CVS en GWI – we focussen ons hier echter zo veel mogelijk op CVS (1994 Center for Disease Control criteria)]
We rapporteerden eerder dat GWI-veteranen kunnen worden onderverdeeld in 2 fenotypes op basis van responsen op de fysiologische stressor van een submaximale inspanning test [Rayhan RU et al. Exercise challenge in Gulf War Illness reveals two subgroups with altered brain structure and function. PLoS One (2013) 8: e63903 – lees dit stuk voor meer uitleg over de STAT- & STOPP-fenotypes van GWI].
Cerebrospinaal vocht [ruggemergvocht, verkregen via lumbaal- of ruggemerg-punktie] werd uitgebreid getest wat micro-RNAs (miRNA), proteomica [Baraniuk JN et al. A Chronic Fatigue Syndrome related proteome in human cerebrospinal fluid. BMC Neurol (2005) 5: 22], metabolomica en andere molekulen om de centrale neurotoxische pathologieën te onderzoeken die werden voorgesteld voor GWI en CVS [Barnden LR et al. Autonomic correlations with MRI are abnormal in the brainstem vasomotor centre in Chronic Fatigue Syndrome. Neuroimage Clin. (2016) 11: 530-7]. miRNAs zijn ca. 22 nucleotide lange, enkel-strengige RNAs overgeschreven van genomisch DNA. Ze vormen het ‘RNA-induced silencing complex’(RISC [een multi-proteïne complex met één streng van een klein interfererend RNA (‘small interfering’ siRNA) of microRNA (miRNA). Het gebruikt het siRNA of miRNA als een patroon voor het herkennen van complementair mRNA. Wanneer het een complementaire streng vindt, aktiveert het RNase.]) en binden op complementaire sequenties in het 3’-onvertaald gebied [‘untranslated region, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie] van mRNAs om translatie te onderdrukken of mRNA-afbraak te bevorderen [Door binding op specifieke plaatsen in het 3’ onvertaald gebied, kunnen miRNAs gen-expressie van meerdere boodschapper-RNAs doen dalen door het inhiberen van de translatie of het direct veroorzaken van degradatie van het transcript.]. miRNAs zorgen op een dynamische manier voor de afstelling van de expressie van de meeste cellulaire proteïnen. Er werd gebruik gemaakt van kwantitative polymerase-ketting-reaktie (QPCR) om miRNAs in het cerebrospinaal vocht te meten.
Onze eerste hypothese was dat CVS, GWI en sedentaire controle -individuen in rust (cvs0, gwi0 & sc0) onderling significante verschillen zouden vertonen qua cerebrospinaal vocht biomerkers. De ‘non-exercise’ groepen rustten overnacht en deden geen inspanningen vóór hun lumbaal-punktie. Er werd voorspeld dat de miRNA-patronen van de ‘non-exercise’ groepen verschillend zouden zijn van andere aandoeningen zoals depressie en fibromyalgie. Ten tweede: de verschillen zouden uitvergroot zijn bij SC, CVS en de via inspanning gedefinieerde START- en STOPP-fenotypes van GWI na inspanning wanneer ze onderling werden vergeleken. Ten derde: verschillen tussen de groepen na inspanning en hun overéénkomstige ‘non-exercise’ vergelijking-groep (SC vs. sc0, CVS vs. cvs0, START vs. gwi0, STOPP vs. gwi0) zouden de effekten van inspanning op het centraal zenuwstelsel en de pathologie van exertionele uitputting vormgeven.
Methodes
Klinische informatie
[…]
GWI en gezonde veteranen, en gezonde, niet-militaire, sedentaire controle (SC) individuen vulden vragenlijsten in aangaande de criteria voor GWI en CVS [‘Chronic Fatigue Syndrome Symptom Severity Questionnaire’], gemeenschappelijke symptomen bij CVS en GWI, levenskwaliteit [SF-36], ‘Generalized Anxiety Disorder’ [veralgemeende angst] screening en ‘Centre for Epidemiologic Studies’ Depressie Schaal scores. Fibromyalgie werd bepaald via pijn plus [‘tenderpoint’-]gevoeligheid (1990 [American College of Rheumatology] criteria). Voor klinische en methodologische details zie Rayhan RU et al. [hierboven]. Alle individuen voerden submaximale fiets-inspanning stress-testen uit op 2 opéénvolgende dagen met ervoor en erna magnetische resonantie beeldvorming, gevolgd door een lumbaal-punktie. De individuen fietsten aan 70% van de leeftijd-voorspelde maximum hartslag gedurende 25 min gevolgd door stapsgewijze toenames van de fiets-weerstand tot 85% van de leeftijd-voorspelde hartslag. De inspanning was vereist om de posturale tachycardie te induceren dat het START-fenotype definieert. […]
Kwantitatieve PCR
[…]
miRNA-selektie
Het eerste niveau van beperking vereistte dat miRNAs detekteerbaar zouden zijn via een PCR-cyclus-drempel (Ct [‘cycle-treshold’; aantal PCR-cycli waarbij het gegenereerd significant boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De Ct is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer van het miRNA aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken]) ≤ 35. miRNAs met Ct > 35 werden bestempeld als “niet-detekteerbaar” en hun Ct werd als 35 ingebracht. Ten tweede: om te worden beschouwd als een bruikbare biomerker, moest een miRNA detekteerbaar zijn met een Ct ≤ 35 bij minstens twee derden van de individuen van een groep.
miRNA-normalisatie en ΔΔCt
[De 2 meest gebruikte methodes om gegevens van kwantitatieve PCR te analyseren zijn absolute en relatieve kwantificatie. De eerste bepaalt het ‘copy-number’ waarbij het PCR-signaal wordt uitgezet op een standaard-curve; de tweede bekijkt het PCR-signaal van het transcript in een groep t.o.v. dat van een ander staal (een controle). De 2(-Delta Delta C(T)) – 2−ΔΔCT – methode is een geschikte manier om de relatieve veranderingen in expressie te analyseren. ΔCt = Ct(een doelwit-gen) minus Ct(een referentie-gen); ΔΔCt = ΔCt(een doelwit-gen) minus ΔCt(een referentie-gen) – Δ staat voor verandering/verschil.]
Er werden 4 normalisatie-strategieën en ΔΔCt-berekeningen vergeleken.
N0-analyse (geen ‘normaliser’ [referentie]) gebruikte de volledige set gegevens (alle Ct > 35 ingebracht als 35). De gemiddelde ΔCt werd berekend voor elke groep, daarna werd ΔΔCt bepaald voor elk groepen-paar. […] Voor de andere ‘normalisers’ gebruikten 2 (N2), 3 (N3) en 6 (N6) miRNAs. Voor elk individu werd de ΔCt berekend: het verschil van de N2, N3 of N6 referenties minus de Ct voor elk van de andere miRNAs. […].
De uitkomsten waren: (i) verschillen tussen ‘non-exercise’ groepen (sc0, cvs0 en gwi0), (ii) verschillen tussen groepen na inspanning (SC, START, STOPP, CVS) en (iii) inspanning-geïnduceerde verschillen tussen elke ‘post-exercise’ groep en z’n overéénkomstige ‘non-exercise’ controle-groep. […].
Resultaten
Demografiek
In de CVS-groepen (cvs0, CVS) zaten meer vrouwen en in de GWI-groepen (gwi0, START, STOPP) meer mannen. De levenskwaliteit, vermoeidheid, cognitie, slaap en pijn waren significant verstoord bij de GWI- en CVS-groepen t.o.v. de sedentaire controles. [Baraniuk JN et al. A Chronic Fatigue Syndrome (CFS) severity score based on case designation criteria. Am. J. Transl. Res (2013) 5: 53-68] Fibromyalgie bleek meer prevalent bij CVS en GWI dan controles. De criteria voor GWI, CVS, veralgemeende angst en depressie hebben vermoeidheid, slaap, cognitie en het sympathisch zenuwstelsel als gemeenschappelijke symptomen. […]
‘Normalisers’
[…]
Voor N2 werd miR-489 & miR-490-3p als referentie gebruikt omdat ze (i) werden gedetekteerd in alle individuen met Ct ≤ 35, (ii) overvloedig aanwezig waren in het cerebrospinaal vocht, (iii) kleine varianties (25.2 ± 0.8 & 25.5 ± 0.9, respectievelijk) hadden met een enge reikwijdte voor Ct (minimum 22.8 – maximum 27.8, en minimum 22.3 – maximum 28.1, respectievelijk) en (iv) niet significant verschilden tussen de groepen […].
De N3 was het gemiddelde van miR-489, miR-490-3p & miR-127-3p (29.3 ± 1.2, minimum 24.2, maximum 35). […]
De N6 werd bekomen door toevoeging van miR-124-3p (30.6 ± 1.7), miR-183-3p (31.8 ± 1.0) & miR-433 (29.9 ± 1.5). […].
Alle miRNA-referenties hadden ΔΔCt < 1.0.
N0 selekteerde 31 miRNAs die voldeden aan de de significantie-criteria […]. N2 identificeerde er 21, N3 24 en N6 vond 23 significante miRNAs. De doorsnede van de 4 ‘normalisers’ identificeerde 18 miRNAs met minimum 1 significant verschil tussen de groepen. […] Er was een uitstekende overéénkomst qua grootte-ordes van ΔΔCt tussen de 4 ‘normalisers’. N0 selekteerde 9 bijkomende miRNAs die niet werden gevonden met N2, N3 & N6. Deze werden als vals-positieven beschouwd.
‘Non-exercise’ groepen
Op basis van onze strikte criteria waren geen enkele van de miRNAs significant verschillend bij de ‘non-exercise’ groepen. De ΔCt-waarden voor miR-22-3p waren hoger bij cvs0 dan bij sc0 maar de verschillen bleken niet significant […].
‘Post-exercise’ groepen
miR-22-3p & miR-9-3p waren de enige miRNAs die significant verschilden tussen de ‘post-exercise’ groepen. miR-22-3p bleek een anomalie omwille van het breed Ct-bereik in alle groepen. miR-22-3p was praktisch niet detekteerbaar bij START en dus waren die niveaus bij START significant verminderd in vergelijking met SC en STOPP. De daling bij START maar relatieve toename bij STOPP ondersteunde de aanwezigheid van 2 GWI-fenotypes. Specificiteit en sensitiviteit was 0.76 voor START versus SC (Ct-drempel 29) en START versus STOPP (Ct-drempel 33).
miR-9-3p vertoonde een andere trend. Enkel de START-groep had detekteerbare niveaus (Ct ≤ 35) bij meer dan twee derden van de individuen. Het verschil tussen START en STOPP was klein maar significant. De lage specificiteit en sensitiviteit van 65% bij een Ct-drempel van 33 weerspiegelt de lage niveaus van miR-9-3p in het cerebrospinaal vocht.
miRNAs verhoogd na inspanning vergeleken met ‘non-exercise’ groepen
Inspanning verhoogde de niveaus van meerdere miRNAs in vergelijking met de overéénkomstige ‘non-exercise’ groepen. SC hadden hogere waarden dan sc0 voor miR-22-3p, miR-30d-5p, miR-204-5p, miR-425-3p & miR-99b-5p. De specificiteiten en sensitiviteiten voor miR-204-5p & miR-22-3p waren 0.80 bij drempels van 31 en 32, respectievelijk.
START hadden verhoogde waarden van miR-425-3p & miR-99b-5p in vergelijking met gwi0. miR-370 werd in bijna alle cerebrospinaal vocht stalen gedetekteerd maar enkel START vertoonden een significante stijging t.o.v. ‘non-exercise’ (ΔΔCt = 1.7 ± 2.1 versus gwi0). STOPP vertoonden ook de inspanning-geïnduceerde stijging van miR-99-5p zoals bij SC en START. De specificiteiten en sensitiviteiten voor miR-99b-5p waren ca. 0.75 bij Ct-drempels van 33 voor SC, START en STOPP t.o.v. hun ‘non-exercise’ controls.
Bij CVS waren er geen stijgingingen van miRNA-waarden in vergelijking met cfs0.
miRNAs verlaagd na inspanning vergeleken met ‘non-exercise’ groepen
miR-328 & miR-608 waren significant gedaald door inspanning bij SC, CVS, START en STOPP t.o.v. de ‘non-exercise’ sc0–, cfs0- en gwi0-groepen. Deze miRNAs waren detekteerbaar in bijna alle cerebrospinaal vocht stalen in deze studie. De specificiteiten en sensitiviteiten voor miR-328 varieerden van 0.74 bij Ct = 23 voor SC, 0.84 voor CVS, 0.86 voor STOPP en 0.91 voor START (Ct-drempels van 23 tot 25). De specificiteiten en sensitiviteiten voor miR-608 varieerden van 0.78 tot 0.83 (drempels = 28). Verlaagd miR-328 & miR-608 kan een gevolg zijn van inspanning die alle individuen beïnvloedt ongeacht hun ziekte-status.
miR-let-7i-5p, miR-200a-5p & miR-93-3p waren significant gedaald bij START, STOPP en CVS in vergelijking met hun gwi0 en cvs0 ‘non-exercise’ controles. Ze bleben onveranderd tussen SC en sc0.
CVS onderscheidde zich van de andere groepen op basis van significante dalingen van miR-126-5p, miR-186-3p, miR-19b-3p, miR-92a-3p & miR-505-3p t.o.v. de ‘non-exercise’ cvs0–groep. De specificiteiten en sensitiviteiten waren ca. 0.82 voor miR-328, miR-608 & miR-92a-3p. Het groot aantal door inspanning geïnduceerde dalingen qua miRNAs differentieerde CVS van SC en de GWI-fenotypes.
Geslacht
miRNA-waarden in het cerebrospinaal vocht was voor vrouwen en mannen in de ‘non-exercise’ en de ‘post-exercise’ groepen gelijkwaardig, uitgezonderd voor een significant hogere waarde van miR-9-3p bij START– t.o.v. STOPP-mannen (ΔΔCt = 1.7 ± 1.4).
De enige door inspanning geïnduceerde verandering bij vrouwen was een daling qua miR-328 in de STOPP–groep vergeleken met gwi0 (5.7 ± 0.8). De groepen ‘post-exercise’ SC- en START–vrouwen (n = 3 elk) waren te klein om betekenisvolle verschillen te betekenen.
De ‘post-exercise’ mannelijke controles hadden significant verhoogde miR-204-3p (4.4 ± 2.8), miR-30d-5p (3.4 ± 2.3) & miR-30a-5p (2.9 ± 2.0) t.o.v. ‘non-exercise’ mannen.
miR-328 was gedaald na inspanning bij mannelijke START (7.2 ± 5.4), STOPP (6.9 ± 4.8) en CVS (5.7 ± 3.7) in vergelijking met ‘non-exercise’ mannen. Mannelijke controles hadden een gelijkaardige magnitude-verandering die niet significant was. STOPP-mannen hadden significant verminderd miR-608 (4.6 ± 3.2) & miR-200a-5p (3.7 ± 2.1).
Deze verschillen waren consistent met de algemene groep-effekten.
Bespreking
Dit is de eerste beschrijving van de effekten van inspanning op miRNA-expressie in het cerebrospinaal vocht bij gezonde individuen. Inspanning verminderde miR-328 & miR-608 bij alle individuen, wat een algemeen effekt op het brein suggereert. Inspanning veroorzaakte afzonderlijke patronen van miRNA-veranderingen bij CVS en de START- & STOPP-fenotypes van GWI, wat wijst op significante pathofysiologische verschillen tussen de aandoeningen.
Anders dan onze start-hypothese waren er geen verschillen qua miRNA-waarden tussen de ‘non-exercise’ groepen controle-, CVS- en GWI-individuen. Daarom zijn ‘baseline’ waarden van cerebrospinaal vocht miRNAs wellicht niet bruikbaar voor diagnose van CVS of GWI.
De enige significante verschillen tussen groepen na inspanning waren verminderd miR-22-3p bij START vergeleken met SC en STOPP, en gestegen miR-9-3p bij START vergeleken met STOPP. Deze verschillen tussen START en STOPP ondersteunen onze 2 GWI-fenotypes [zie Rayhan RU et al. hierboven].
De meest opvallende bevindingen waren de veranderingen tussen ‘post-exercise’ groepen en hun overéénkomstige ‘non-exercise’ vergelijking-groepen. SC hadden 5 verhoogde miRNAs na inspanning, vergeleken met 3 voor START, 1 voor STOPP, en geen bij CVS.
[…]
miR-let-7i-5p, miR-93-3p & miR-200a-5p waren significant verminderd na inspanning bij START, STOPP en CVS, maar niet bij SC. Dit was consistent met een kardinale bevinding bij CVS en GWI: het funktioneren mag normaal lijken in rust maar zal verslechteren na een fysiologische stressor. miR-let-7i was gereduceerd in het plasma na inspanning bij atleten [Nielsen S. et al. The miRNA plasma signature in response to acute aerobic exercise and endurance training. PLoS One (2014) 9: e87308]. De expressie van miR-let-7i is gedaald in de pre-frontale cortex van ratten-model voor depressie. IL6 is een doelwit van miR-let-7i en, zoals voorspeld, was dit cytokine significant gestegen in de hersenen van deze ratten. Wanneer deze ratten toegang tot een loop-rad kregen, verhoogde hun miR-let-7i expressie en daalde hun IL6. Modulatie van miR-let-7i en IL-6 kan bijdragen tot inspanning-geïnduceerde voordelen bij ‘inflammatoire’ depressie. miR-let-7i draagt ook bij tot de regulering van acetylcholine’s muscarine en α4β2 nicotine receptoren [mediëren de fysiologische funkties van de neurotransmitter acetylcholine (ACh)], en de epigenetische regulering van acetylcholinesterase [enzyme dat de afbraak van ACh in choline en acetaat katalyseert]. Deze dieren-modellen zijn wellicht niet geschikt voor CVS of GWI omdat menselijke individuen exertionele inspaning na inspanning ontwikkelen en het is onwaarschijnlijk dat ze spontaan hun inspanning-niveau significant zouden verhogen als ze een loop-band kregen [Keller BA, Pryor JL & Giloteaux L. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J. Transl. Med. (2014) 12: 104].
In de CVS-groep waren 12 miRNAs gereduceerd na inspanning. miR-186-3p was gedaald bij ouder-wordende muizen waar het zich richt op ‘β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1’ (BACE1 [beta-secretase-1; enzyme dat van belang is bij de vorming van de myeline-schede van perifere zenuwen]) mRNA. Verminderd miR-186-3p laat verhoogde BACE1 mRNA translatie en splitsing van amyloïde peptiden (dat het risico op hersen-ziekte verhoogt) toe. miR-19b-3p bleek gereduceerd in het serum van patiënten met Alzheimer’s, en had ‘signal transduction and activator of transcription 3’ (STAT3 [een transcriptie-factor]) mRNA als doelwit in een muizen-model. miR-92a-3p bleek verhoogd bij glioblastoma [type hersen-kanker] en richtte zich op BCL2L11 [het proteïne gecodeerd door dit hen behoort tot de BCL-2 familie, die werken als anti- of pro-apoptotische regulatoren] om tumor-apoptose te verminderen. De daling ervan na inspanning kan apoptose bij CVS bevorderen. In endotheliale cellen kwam miR-126-5p sterk tot expressie; waar het vasculair (VCAM), intercellulair (ICAM) en geaktiveerd leukocyten (ALCAM) cel-adhesie molekule boodschapper-RNAs als doelwit heeft en dus trans-endotheliale migratie reduceert. Dit is relevant voor immuun-cel influx in de hersenen en hypothesen van neuro-inflammatie bij CVS-pathogenese.
Neuronen kunnen de bron zijn van miR-124-3p, miR-127-3p, miR-433 & miR-323b-5p. Er was weinig overlap met de miRNAs gesynthetiseerd in astrocyten, oligodendrocyten en microglia.
Het epithelium [‘dekweefsel’] van de plexus chorioideus [gebieden aan de rand van hersen-ventrikels waar hersenvocht wordt aangemaakt] kan een primaire bron zijn van miRNAs in het cerebrospinaal vocht. Epitheel-cellen vormen een ééncellige laag verbonden met ‘tight-junctions’ [membranen van cellen komen samen en vormen een soort barrière zodat substanties verplicht worden de cel binnen te dringen om door het weefsel te raken, zodat er controle is over welke toegelaten worden en welke niet] die de strakke cellulaire barrière rond gefenestreerde capillairen [met fenestraties; kleine openingen, poriën] creëeren. Interferon-gamma en andere mediatoren die opgewekt worden door inspanning, inflammatie en andere stressoren, werken op een directe manier op de plexus chorioideus om barrière-permeabiliteit, plasma proteïnen-transport, proteïne-synthesis en sekretie van nutrienten in het cerebrospinaal vocht te moduleren. miR-328, dat bij alle individuen aanwezig was en daalde na inspanning, bindt op de 3’-onvertaalde gebieden [zie hierboven] van bepaalde boodschapper-RNAs om extracellulaire barrière funkties te moduleren. Plexus chorioideus miRNAs worden verpakt in extracellulaire vesikels en afgegeven in het cerebrospinaal vocht. Doelwitten omvatten subventriculaire neurale stamcellen, rijpe neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, microglia, meningeale en centrale immuun-cellen. Blokkage van extracellulaire vesikel sekretie door [epitheel]cellen van de plexus chorioideus verminderden hersen-inflammatie in een muizen-model met lipopolysaccharide-geïnduceerde inflammatie. Plexus chorioideus miRNAs kunnen nieuwe doelwitten zijn om acuut ziekte-gedrag, koorts en chronische pijn bij systemische ziekten te moduleren.
De plexus chorioideus is dysfunktioneel bij de ziekte van Alzheimer. Dit levert de rationale om de rol van de barrière bloed/cerebrospinaal vocht te overwegen bij de cognitieve dysfunktie van CVS en GWI. Er zijn talrijke rapporten over gestegen en gedaalde miRNAs in het cerebrospinaal vocht bij Alzheimer’s maar geen enkele kwam overéén met de patronen van onze groepen hier. miR-let-7i-5p was verhoogd bij de ziekte van Alzheimer maar de waarden waren gelijkwaardig met de de ‘non-exercise’ groepen.
Depressie behoort bij de differentiële diagnose omwille van de gemeenschappelijke diagnostische criteria. Majeure depressie wordt gedefinieerd als “affectieve dysfunktie met droevigheid, afgevlakte emoties en anhedonie als essentiële kenmerken”, gevolgd door secundaire criteria zoals vermoeidheid, cognitieve problemen, slaap-stoornissen en somatische dysfunktie. De vraaglijsten naar depressie beklemtonen echter de somatische symptomen. Klachten omtrent vermoeidheid, slaap en cognitieve dysfunktie zullen de totale scores opdrijven en kunnen leiden tot vals-positieve conclusies van majeure depressie zelfs als anhedonie of affectieve klachten afwezig zijn. Dit is bijzonderlijk problematisch bij CVS en GWI waar deze kenmerken behoren tot de diagnostische criteria. Ten gevolge daarvan waren de ‘Centre for Epidemiology-Depression’ (CESD) scores significant verhoogd voor GWI (78,3%), CVS (64,0%) en controles (25,0%).
Kwantitatieve PCR van miRNAs biedt een objectievere oplossing. miR-16 in het cerebrospinaal vocht was significant lager bij patiënten met majeure depressie dan bij controle-individuen. Dit werd echter niet bevestigd bij een onafhankelijke groep die een verschillende patroon (11 significant verhoogde en 5 gedaalde miRNAs) had. Onze gegevens bevestigden geen enkele van deze bevindingen omdat slechts 3 van de miRNAs gedetekteerd werden met Ct ≤ 35 bij meer dan twee derden van onze ‘non-exercise’ groep. miR-425-3p was significant gereduceerd bij depressie-patiënten en werd gedetekteerd bij ongeveer de helft van alle ‘non-exercise’ individuen. Het was verhoogd na inspanning bij SC, START en STOPP maar niet bij CVS. Het gebrek aan reproduceerbaarheid [bij depressie] benadrukt de noodzaak miRNA-bevindingen onafhanhelijk te verifiëren en ondersteunt onze rationale voor strikte statistische criteria om potentiële miRNA-biomerkers te definiëren.
De pijn en gevoeligheid van GWI-individuen gaf systemische hyperalgesie [verhoogde pijngevoeligheid] aan en suggereerde parallellen met fibromyalgie. Er waren 9 miRNAs virtueel ondetekteerbaar bij 10 vrouwen met fibromyalgie vergeleken met 8 gezonde vrouwelijke controles. miR-99b-5p & miR-29a-3p waren afwezig bij fibromyalgie maar werden gedetekteerd bij meer dan twee derden van onze deelnemers. miR-99b-5p was significant verhoogd na inspanning bij SC, START en STOPP. De andere 7 miRNAs werden gedetekteerd bij minder dan de helft van onze specimen. Dit suggereert dat GWI en CVS verschillen van fibromyalgie.
Beperkingen voor het diagnostisch gebruik van kwantitatieve miRNA-analyse in cerebrospinaal vocht omvatten het opmerkelijk gebrek aan consensus omtrent miRNA-waarden bij controle-individuen. Dit kan worden verholpen d.m.v. standardisatie van reagentia en protocollen, ‘open-source’ delen van studie-uitkomsten en meta-analyse van ruwe gegevens. De opbrengst van geëxtraheerd miRNA en detekteerbaarheid werden verbeterd door het gebruik van 0,5 ml i.p.v. 0,2 ml cerebrospinaal vocht. QPCR zonder Ct ‘cut-offs’ ≤ 35 cycli deed het aantal amplificatie-artefacten [sequenties die niet natuurlijk aanwezig zijn maar het kunstmatig gevolg zijn van de methodologie] dalen. De brede ‘range’ van miR-22-3p Ct-waarden kan te wijten zijn aan commerciële wijzigingen aan de reagentia ontworpen voor het verbeteren van miRNA-detektie. Zeer overvloedige miRNAs die werden gedetekteerd met Ct < 35 bij alle individuen werden gebruikt als ‘normalisers’ […]. Er werd gefocust op miRNAs die werden gedetekteerd bij meer dan twee derden van de individuen per groep die succesvolle biomerker-kandidaten voor gebruik in de algemene populatie kunnen zijn. De leeftijden waren vergelijkbaar tussen de groepen en er waren geen verschillen qua expressie tussen vrouwen en mannen. ‘Next-generation’ sequentie-bepaling is een uitstekend instrument maar heeft zorgvuldige interne standardisatie nodig om net zo gevoelig te zijn als QPCR. Voldoende grote stalen waren essentieel omdat onze initiële bevindingen met ca. een dozijn individuen per groep verschillen tussen START en STOPP na inspanning toonden [Baraniuk JN & Shivapurkar N. Cerebrospinal fluid MicroRNA (miRNA) in CFS and Gulf War Illness (GWI). International Association for Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (IACFSME). Fort Lauderdale, 2016] maar deze verschillen kwamen tenslotte terug naar het gemiddelde naar gelang meer individuen werden geanalyseerd. Dit is bijzonder pertinent voor kleinere studies die de differentiële diagnose van CVS en GWI onderzoeken [bv. Bjersing JL et al. Profile of cerebrospinal microRNAs in fibromyalgia. PLoS One (2013) 8: e78762 /// Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One (2014) 9: e102783].
Beperkingen van het test-paradigma omvatten de intensieve aard van de inspanning en MRI-karakterisatie van GWI-individuen om hun fenotypes te bepalen. Er was een lumbaal-punktie vereist voor het verkrijgen van de cerebrospinaal vocht miRNA-biomerkers maar deze procedure is geen contra-indicatie voor het stellen van een objectieve diagnose van. Integendeel: magnetische resonantie beeldvorming met cerebrospinaal vocht QPCR miRNA-profiliering kunnen complementaire instrumenten zijn voor de diagnose van of CVS, GWI en hun subtypes.
Besluiten
De waarden van miRNA in het cerebrospinaal vocht waren gelijkwaardig tussen SC-, CVS- en GWI-individuen die hadden gerust voor inspanning (‘non-exercise’ groepen). De miRNA-waarden waren verschillend van deze die gewijzigd bleken bij depressie, fibromyalgie en Alzheimer’s, wat suggereert dat dit allemaal afzonderlijke ziekten zijn, of dat de gegevens van deze kleinere studies niet konden worden gerepliceerd in deze grotere studie. De miRNA-waarden waren gelijkwaardig tussen de ‘post-exercise’ SC, CVS en GWI-fenotypes (START & STOPP) met uitzondering van miR-22-3p & miR-9-3p die START en STOPP significant onderscheidden. Dit voegt een andere vorm van bewijs toe ter ondersteuning van een neurotoxische pathologie voor GWI en deze 2 GWI-fenotypes. De ‘post-exercise’ waren significant verhoogd (n = 6) of verlaagd (n = 12) t.o.v. de ‘non-exercise’ vergelijking-groepen. miR-328 en miR-608 waren gestegen bij SC, CVS, START en STOPP, en kunnen een globale merker zijn voor de inspanning-stressor op de plexus chorioideus en de hersenen.
CVS had 12 verminderde en 0 vermeerderde miRNAs na inspanning, wat er op wijst dat z’n pathofysiologie en responsen op inspanning uniek zijn in vergelijking met GWI en controless. Ondanks de overlap van symptomen van CVS, GWI en andere ziekten bij de differentiële diagnose, impliceren de afzonderlijke inspanning-geïnduceerde miRNA-patronen in het cerebrospinaal vocht afzonderlijke mechanismen voor post-exertionele malaise bij deze ziekten.