In ‘Mest-cellen & Substantie-P’ hadden we het over de concepten van Prof. dr Theoharis C. Theoharides van de ‘Tufts University School of Medicine’. Een ander research-team had ook al gerapporteerd over de rol van mest-cellen bij Posturaal Orthostatisch Tachycardie Syndroom (‘Mest-cel aktivatie aandoeningen bij POTS (& CVS ?)’). Theoharides beschreef wetenschappelijk onderzoek betreffende de rol van mest-cellen en histamine in de hersenen. Dit zou ook van belang kunnen zijn bij M.E.(cvs). Lees ook: ‘Hersen-mist, inflammatie – behandeld met luteoline?’, ‘Mest-cel aktivatie aandoeningen bij POTS (& CVS?)’ & ‘Neuro-inflammatie bij Myalgische Encefalomyelitis (CVS) – een PET-studie’.
De hieronder gerapporteerde resultaten zijn preliminair en dienen zeker te worden bevestigd. Ze geven aan dat er een verschil is wat betreft de mest-cellen tussen patiënten met matige en ernstige M.E.(cvs). Meer mest-cellen en of een verandering van mest-cel aktiviteit zou inflammatoire reakties kunnen veroorzaken. Als de bevindingen stand houden bij replicatie (het gaat hier nl. over een zeer beperkte groep), dient men na te gaan wat oorzaak en wat gevolg is; en het zou ook interessant zijn meer te weten over wat er gebeurt bij inspanning. In elke geval is dit artikel het eerste dat experimentele gegevens over mest-cellen bij M.E.(cvs)-patiënten biedt.
————————-
Asian Pacific Journal of Allergy & Immunology 2016 [pre-print]
Novel characterisation of mast cell phenotypes from peripheral blood mononuclear cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients
Thao Nguyen (1,2), Samantha Johnston (1,2), Anu Chacko (1,2), Damien Gibson (1,2), Julia Cepon (1,2), Peter Smith (2), Donald Staines (1,2), Sonya Marshall-Gradisnik (1,2)
1 School of Medical Science, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia
2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD Australia
Samenvatting
ACHTERGROND: Mest-cellen (MCs) mediëren inflammatie via neuropeptiden en cytokinen, samen met histamine en reaktieve zuurstof soorten (ROS). Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een ziekte die wordt gekenmerkt door een onverklaarde uitputtende vermoeidheid met meerdere fysiologische stoornissen en ontregelde cytokine-profielen.
DOELSTELLING: Het bepalen van mest-cel fenotypes in geïsoleerde menselijke PBMCs, van gezonde controles en CVS/M.E.-patiënten. Het bepalen van receptor expressie van RAGE en z’n ligand ‘high mobility group box 1’ proteïne (HMGB1).
METHODE: Patiënten met matige CVS/M.E. (n = 12, gemiddelde leeftijd 39,25 ± SD 3,52 jaar), patiënten met ernstige CVS/M.E. (n = 6, gemiddelde leeftijd 43,00 ± SD 4,02 jaar) en gezonde controles (n = 13, gemiddelde leeftijd 42,69 ± SD 3,87 jaar) werden in deze studie opgenomen. De CVS/M.E.-patiënten kregen de diagnose via de 2011 Internationale Consensus Criteria [Carruthers BM et al. Myalgic Encephalomyelitis: International Consensus Criteria. J Intern Med. (2011) 270: 327-38]. Er werd flow-cytometrie aangewend voor het identificeren van de fenotypische perifere mest-cel populatie in PBMCs gebruikenmakend van een exclusie-merker cocktail (anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD20 & anti-CD56) en inclusie-merkers (CD117 [cel-oppervlakte proteïne gebruikt om bepaalde types bloedcel-voorlopers te identificeren], CD34 [antigen van hematopoietische (bloedvormende) voorloper-cellen], FCεRI [receptor met hoge affiniteit voor een deel van immunoglobuline-E, een antilichaam betrokken bij allergie en immuniteit tegen parasieten], chymase [type protease (proteïne-splitsend enzyme) voornamelijk aanwezig in mest-cellen], HLA-DR & CD154). De expressie van HMGB1 en oplosbaar RAGE werd gemeten in het plasma.
RESULTATEN: Er was een significante toename qua CD117+CD34+FCεRI–chymase– mest-cel populaties bij patiënten met matige en ernstige CVS/M.E. t.o.v. de gezonde controles. Er was een significante toename qua CD40-ligand en MHC-II receptoren op gedifferentieerde mest-cel populaties bij ernstige CVS/M.E. in vergelijking met gezonde controles en patiënten met matige CVS/M.E. Er waren geen significante verschillen voor HMGB1 & sRAGE tussen de groepen.
BESLUITEN: Deze preliminaire studie onderzocht mest-cel fenotypes in PBMCs van gezonde controles. We rapporteren een significante stijging van naïeve MCs bij matige en ernstige CVS/M.E. vergeleken met gezonde controles. Bovendien was er een significante toename qua CD40-ligand en MHC-II receptoren op gedifferentieerde mest-cellen bij ernstige CVS/M.E. Perifere MCs zouden van belang kunnen zijn bij CVS/M.E.-pathologie maar er is echter verder onderzoek vereist om hun rol te bepalen.
Inleiding
Mest-cellen (MCs) worden gevonden in het bloed waar ze circuleren in een onrijpe vorm, vooraleer ze migreren naar weefsels, waar ze differentiëren naar funktionele cellen zoals bindweefsel- (serosale [van de serosa of sereuze – vochtafscheidende – membranen vliezen]) en mucosale [van de musoca (slijmvliezen)] MCs. Belangrijk: rijpe cellen circuleren gewoonlijk niet in het perifeer bloed aangezien ze vrijkomen als onrijpe cellen in het perifeer bloed waarna ze migreren over het gans het lichaam naar weefsels zoals de huid, mucosa, hersenen en luchtwegen, waar ze rijping ondergaan. Stamcel-factor, ook gekend als c-kit [CD117], is het ligand voor de receptor die verantwoordelijk is voor de overleving en ontwikkeling van MCs. Bijkomend zijn immuun-modulatoren – zoals groei-factoren, cytokinen en chemokinen – in staat MCs en hun fenotypes te beïnvloeden. MC-fenotypes worden verder gedefinieerd volgens hun protease-inhoud. MC-aktivatie en -degranulatie kan gebeuren via FCεRI (IgE ‘cross-linking’ [Binding van antigenen met IgE dat reeds gebonden is met FcεRI op mest-cellen veroorzaakt ‘cross-linking’ van gebonden IgE en de aggregatie van het FcεRI, wat aanleiding geeft tot degranulatie en de afgifte van mediatoren door de cellen.]) of onafhankelijke mechanismen zoals andere immunoglobulin-receptoren (FCγR), cytokinen, chemokinen, neuropeptiden en via receptoren betrokken bij mest-cel interaktie met omringende immuun-cellen (MHC-II, CD40L, OX40). Het MC-fenotype wordt bepaald door het niveau van oppervlakte-expressie van de belangrijkste differentiërende CD-merkers zoals CD117 (c-kit), FCεRI & CD33, waarbij ‘bright’ [helder] & ‘dim’ [dof] populaties kunnen worden gezien, samen met de oppervlakte-expressie van CD34. De CD34 merker komt tot expressie tijdens de onrijpe stadia van de MC. Mest-cellen die gedifferentieerd, rijp of geaktiveerd zijn, brengen FCεRI & HLA-DR tot expressie. Geaktiveerde MCs produceren meerdere pro-inflammatoire mediatoren en geven ze af uit intracellulaire voorraden die de inflammatoire omgeving veranderen om immuun-cellen te mobiliseren naar de plaats van de pathogene infektie en om lymfeknopen te draineren. Belangrijk is dat menselijke MC-fenotypes werden gekarakteriseerd in beenmerg en weefsels bij pathologische ziekten. Ze werden nog niet goed gekarakteriseerd in het perifeer bloed.
Onderzoeken hebben MC-fenotypes gekarakteriseerd uit beenmerg en weefsels bij pathologische ziekten gebruikmakend van methodes die slecht reproduceerbaar/duur zijn, met biologische eigenschappen die verschillen van in vivo (menselijk primair cel-cultuur model of primaire cel-lijnen). Er is dus nood aan het ontwikkelen van een relevant, reproduceerbaar en goedkoop in vitro model om de morfologische en biologische eigenschappen weer te geven van MCs die worden gevonden in vivo. Daarom zal de identificatie van MCs uit het perifeer bloed d.m.v. flow-cytometrische methodes, MC-fenotype en -funktie bij gezonde mensen en bij ziekten vergemakkelijken en ophelderen.
Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een invaliderende heterogene aandoening met immune, neurologische, musculoskeletale, gastro-intestinale en autonome symptomen. De etiologie van CVS/M.E. is niet gekend maar immuun-dysfunktie bleek echter consistent betrokken bij het pathomechanisme van de ziekte. Atypische niveaus van regulerende T-cellen (Treg), en pro-inflammatoire en anti-inflammatoire cytokinen, aanmaak van stikstof-oxide en hypersensitiviteit-responsen suggereren dat bij de pathofysiologie van CVS/M.E. de aktivatie van inflammatoire mechanismen betrokken zijn. [Buchwald D et al. Markers of inflammation and immune activation in chronic fatigue and Chronic Fatigue Syndrome. J. Rheumatol. (1997) 24: 372-6 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88] Nucleaire factor kappa beta (NF-κB) is een transcriptie-factor die een rol speelt bij inflammatoire mechanismen, cel-proliferatie, -differentiatie en -overleving. Andere onderzoekers rapporteerden significante stijgingen qua NF-κB bij CVS/M.E.-patiënten.
De ‘Receptor for Advanced Glycation End-products’ (RAGE) [glycatie = niet-enzymatische glycosylatie; binden van suiker-molekulen] is een multi-ligand lid van de immunoglobuline-superfamilie van cel-oppervlakte molekulen. De liganden omvatten het ‘high mobility group box 1’ proteïne (HMGB1 [een celkern-proteïne dat passief wordt afgegeven door necrotische cellen en aktief wordt gesecreteerd in respons op inflammatoire stimuli]) en AGEs, die gekend zijn om hun belangrijke rol bij de amplificatie van chronische inflammatie en geassocieerd zijn met inflammatie. Vandaar dat het belangrijk is te weten of zelf-bestendigende inflammatoire signalen aangekondigd worden door mest-cellen geaktiveerd door RAGE bij CVS/M.E.
Het doel van dit onderzoek was MC-fenotypes te identificeren in geïsoleerde menselijke PBMCs d.m.v. flow-cytometrie en de oplosbare receptor RAGE, alsook z’n ligand ‘high mobility group box 1’ protïne (HMGB1), bij gezonde controles en CVS/M.E.-patiënten.
Methodes
Individuen
De CVS/M.E.-patiënten werden gematcht voor leeftijd met de gezonde controles: 13 gezonde controles (42,69 ± 3,87 jaar), 12 patiënten met matige CVS/M.E. (39,25 ± 3,52 jaar) en 6 met ernstige CVS/M.E. (43,00 ± 4,03 jaar). De diagnose CVS/M.E. werd gesteld volgens de Internationale Consensus Criteria […]. De ernst van de vermoeidheid en groepering van de CVS/M.E.-patiënten werd bepaald op basis van Dr David Bell’s invaliditeit-schaal (DBDS). Matige CVS/M.E. = score van 30% of hoger op de DBDS. Ernstige CVS/M.E. = score van minder dan 30% op de DBDS (huis- of bed-gebonden). […]
[…]
Mest-cel fenotype immuun test
Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werden geïsoleerd om granulocyten (neutrofielen, basofielen en eosinofielen) te helpen verwijderen en kleuring met trypaan-blauw stelde de cel-leefbaarheid vast. […].
Flow-cytometrie
[…] Exclusie-merkers: Lin2 [lineage = afstammingslijn] cocktail (anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD20 & anti-CD56) om lymfocyten, monocyten, eosinofielen en neutrofielen uit te sluiten. Inclusie-merkers en proteïne ter identificatie van de mest-cellen: CD117, CD34, FCεRI & chymase. De mest-cellen werden verder gekarakteriseerd d.m.v. interaktie-merkers: HLA-DR (MHC-II), CD154 (CD40L). De mest-cel subsets werden gedefinieerd als mest-cel voorloper (CD117+CD34+FCεRI–chymase–), rijpe mest-cel (CD117+CD34–FCεRI–) en geaktiveerde mest-cel (CD117+CD34–FCεRI–HLA-DR+CD40L+).
HMGB1 & sRAGE ELISA
[..]
Statistische analyses
[…]
Resultaten
Er waren geen significante verschillen tussen de groepen wat betreft geslacht, leeftijd en pathologie [gezond – matige CVS/M.E. – ernstige CVS/M.E.]. Er was een significant verschil tussen de groepen voor de Dr Bell’s vermoeidheid-score: de gemiddelde score voor de gezonde controle-groep was 92%; de gemiddelde score voor de groepen met matige en ernstige CVS/M.E. was 53% & 25%, respectievelijk.
Identificatie van menselijke mest-cellen in perifeer bloed
De Lin2 monoclonale antilichamen cocktail (anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD20 & anti-CD56) werd gebruikt om immuun-cellen (T-cellen, B-cellen, ‘Natural Killer’ cellen, monocyten, eosinofielen en neutrofielen) te labelen De cellen gelabeld met een myeloïde receptor (anti-CD117) werden beschouwd als CD117+ [voorbestemd om (rijpe) mest-cellen te worden]. CD117+ mest-cellen werden verder gelabeld met anti-CD34 & anti-FCεRI om 4 verschillende fenotypes te differentiëren: FCεRI+CD34–, FCεRI+CD34+, FCεRI–CD34– en FCεRI–CD34+. De 4 fenotypes vertoonden ook lage en sterke expressie voor intracellulair chymase, en interaktie-receptoren CD40L [CD40 ligand; regelt de B-cel rijping, pro-inflammatoire merker] en ‘major histocompatibility complex’ klasse-II (MHC-II). De FCεRI+CD34– vertoonden hogere expressie qua CD40L & MHC-II. Terwijl de FCεRI+CD34+ en de FCεRI–CD34+ populatie ‘low/dim’ expressie qua MHC-II receptoren en negatieve expressie qua CD40L vertoonden. Zowel MHC-II & CD40L receptoren vertoonden negatieve expressie op de FCεRI–CD34–.
Verhoogde waarden van mest-cel voorlopers bij matige en ernstige CVS/M.E.
Mest-cellen met CD117+CD34+FCεRI– die geen intracellulair chymase tot expressie brachten werden vergeleken (controle, matige & ernstige CVS/M.E.). CD117+CD34+FCεRI–chymase cellen bleken significant verhoogd bij de patiënten met matige én ernstige CVS/M.E. vergeleken met de gezonde controle groep. Er werd geen verschil gezien tussen andere subsets.
Upregulering van perifere mest-cel interaktie receptoren bij ernstige CVS/M.E.
De oppervlakte-merkers CD154 en HLA-DR receptoren werden vergeleken tussen controle, matige en ernstige CVS/M.E. Er was een significante toename qua CD154 (CD40L) & HLA-DR (MHC-II) receptoren voor de patiënten met ernstige CVS/M.E. vergeleken met de gezonde controles en de patiënten met matige CVS/M.E.
sRAGE en z’n ligand HMGB1 bij ernstige CVS/M.E.-patiënten
Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft HMGB1 & sRAGE.
Bespreking
Dit artikel rapporteert, voor de eerste keer, over de identificatie van MC-fenotypes in PBMCs van gezonde individuen. Er werden voor het eerst flow-cytometrische methodes gebruikt op basis van een cocktail met inclusie en exclusie cel-merkers, samen met cel-oppervlakte merkers CD154 & MHC-II (HLA-DR). We konden MC-voorlopers (CD117+CD34+FCεRI–chymase), rijpe MCs (CD117+CD34–FCεRI–) en geaktiveerde MCs (CD117+CD34–FCεRI–HLA-DR+CD40L+) identificeren in menselijke PBMCs van gezonde individuen. In het vergelijkend onderzoek rapporteren we ook nieuwe bevindingen van een significante toename qua CD117+CD34+FCεRI–chymase– MC bij matige en ernstige CVS/M.E. in vergelijking met gezonde controles. We waren ook de eersten om een significante toename qua CD40 ligand en MHC-II receptoren te rapporteren op gedifferentieerde MC-populaties bij patiënten met ernstige CVS/M.E. (t.o.v. de groep gezonde controles en patiënten met matige CVS/M.E.).
Een bijzondere sterkte van deze studie is dat het de identificatie ondersteunt van MC-fenotypes en receptor-expressie in geïsoleerde menselijke PBMCs d.m.v. flow-cytometrische technieken zonder de nood aan morfologische en op cel-culturen gebaseerde karakterisatie.
Onze research-bevindingen rapporteren een significante toename qua mest-cel voorlopers (MCPs) (CD117+CD34+FCεRI–chymase–) bij zowel matige als ernstige CVS/M.E. t.o.v. controles. MCPs circuleren in het bloed en lymfatische kanalen, en migreren naar perifere weefsels bij inflammatie. MCPs hebben een uitgebreid proliferatie-potentieel en kunnen differentiëren naar bindweefsel en mucosale mest-cellen afhankelijk van de factoren aanwezig in de micro-omgeving van het weefsel. Rijpe mest-cellen zijn afgeleid van MCPs onder de invloed van stamcel-factor (SCF) die lokaal wordt gesecreteerd door fibroblasten, stromale cellen [steun-cellen] en endotheliale cellen. Mest-cel rijping en biologische expressie in de micro-omgeving van het weefsel wordt beïnvloed door cytokinen – in het bijzonder IL-4, IL-10, IL-17, TNF-α & IFN-γ – waarvan werd gerapporteerd dat ze verhoogd zijn bij in CVS/M.E.-patiënten: dit suggereert dat deze cytokinen de micro-omgeving van het weefsel kunnen beïnvloeden bij CVS/M.E.-patiënten en bijgevolg de proliferatie en differentiatie van MCPs naar rijpe mest-cellen. [Peterson D, Brenu EW et al. Cytokines in the Cerebrospinal Fluids of Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Mediators Inflamm. (2015) 2015: 4 /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. ( 2012) 10: 88]
Mest-cellen brengen een brede waaier aan cel-oppervlakte receptoren en liganden tot expressie, die de communicatie met immuun-cellen behorend tot de aangeboren en verworven immuniteit mediëren, alsook met niet-immune weefsel-specifieke cel-types. Onze nieuwe ontdekking betreffende de significante toename qua CD154 (CD40L) & HLA-DR (MHC-II) receptoren bij ernstige CVS/M.E. vs. gezonde controles en bij matige CVS/M.E. suggereert dat MCs, macrofagen en gliale cellen die CD40L tot expressie brengen, mogelijks een rol spelen bij het mediëren van immune ontregeling van B- & T-cel responsen, alsook bijdragen tot neuro-inflammatie bij CVS/M.E. MHC-II expressie op MC ondersteunt de T-cel proliferatie en effector-funkties, wat daaropvolgend leidt tot expansie van Tregs en B-cel proliferatie. Belangrijk: andere onderzoekers hebben verhoogde aantallen Tregs, B-cel fenotypes en inflammatie bij in CVS/M.E.-patiënten gerapporteerd. [Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-42]
Het is bekend dat RAGE een rol spelt bij in MC-aktivatie: het werd geïdentificeerd op serosale en mucosale mest-cellen. De mechanismen die werden voorgesteld met betrekking tot RAGE-aktivatie van MC omvatten de produktie van reaktieve zuurstof soorten (ROS) en histamine-afgifte die betrokken zou kunnen zijn bij sensitiviteit, allergische reakties en immuun-inflammatie. Multipele chemische sensitiviteit bv., is een co-morbiditeit van CVS/M.E. Afgescheiden RAGE en z’n ligand, HMGB1, verschilde niet significant tussen de groepen. Verder onderzoek naar de RAGE-receptor op MC kan de MC inflammatoire respons bij in CVS/M.E.-patiënten helpen begrijpen.
Mest-cel aktivatie bleek geassocieerd met dysfunktie van de bloed-hersen-barrière (BBB) zoals neuro-inflammatie. Neuro-inflammatie werd d.m.v PET-scans vastgesteld bij CVS/M.E.-patiënten. [Nakatomi Y, Mizuno K, Ishii A, Wada Y, Tanaka M, Tazawa S et al. Neuro-inflammation in Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Nuclear Medicine (2014) 55: 945-50] Tijdens neuro-inflammatie kunnen mest-cellen reageren op neuropeptiden, zoals vaso-aktief intestinaal polypeptide (VIP [zie o.a. ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiële biomerkers bij M.E.(cvs)’ & ‘Cerebrale inflammatie? TNF-α, Microglia, Bloed-Hersen-Barrière’]) […]. We hebben gerapporteerd over verhoogde VIP receptor (VPAC2) [Ook Light et al. rapporteerden dat de vaso-aktief intestinaal peptide receptor (ook VIPR2 genaamd) gelinkt bleek met vermoeidheid- en pijn-ernst bij M.E(cvs); zie ‘Piloot-studie gen-expressie bij kanker versus M.E.(cvs)’.] op CD4+ T-cellen en gedaald IL-10 in cerebrospinaal vocht van CVS/M.E.-patiënten. Verder hadden CVS/M.E.-patiënten, vergeleken met controles, significant verhoogd serum IFN-γ, IL-5 & IL-10. [Wong N, Nguyen T, Brenu EW, Broadley S, Staines D, Marshall-Gradisnik S. A Comparison of Cytokine Profiles of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis Patients. Intl J Clin Med (2015) 6: 769-783; zie ook ‘Variaties qua cytokinen bij M.E.(cvs)’] Stijging qua IFN-γ is opmerkenswaardig, omdat het een sterk cytokine is voor antigen-presentatie en expressie van MHC-II op mest-cellen. Detektie van perifere MC kan mogelijks verdere mechanismen van neuro-inflammatie in de hersenen van CVS/M.E.-patiënten ophelderen.
Besluit
We hebben geaktiveerde mest-cellen ontdekt, voor de eerste keer, bij CVS/M.E.-patiënten alsook mest-cel fenotypes geïdentificeerd in het bloed van gezonde controles. Bovendien vereist de vermoedelijke distributie van geaktiveerde mest-cellen in bijna alle weefsels en organen in het lichaam verder onderzoek om vast te stellen of ze een rol spelen in het pathomechanisme van CVS/M.E. Belangrijk: neuro-inflammatoire processen en hun gevolgen met betrekking tot de bloed-hersen-barrière en het brein-parenchym [funktioneel orgaan-weefsel] dienen verder te worden onderzocht bij deze patiënten.
————————-
Lawrence B. Afrin een klinicus, hematoloog en ook specialist op gebied van mest-cellen (Division of Hematology, Oncology and Transplantation, University of Minnesota, Minneapolis, USA) schrijft in één van zijn artikels (‘Mast cell activation disease and the modern epidemic of chronic inflammatory disease’; (Translational Research (2016) 174: 33-59) dat mest-cel aktivatie syndroom een mogelijke onderliggende/verenigende verklaring is voor een diverse waaier aan kwalen met een inflammatoire component (bv. astma, prikkelbare darm syndroom, fibromyalgie, M.E.(cvs), obesitas, diabetes mellitus, artheriosclerose). In verband met M.E.(cvs) verwijst hij ook naar het werk van Theoharides…
